バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子
Summary
このプロトコルでは、磁性粒子の合成と DNA 結合の動的・電気泳動光散乱法による評価について説明します。粒子サイズ、彼らの多分散性の変化の監視に焦点を当てこのメソッドとを担う粒子表面のゼータ電位の主要な DNA など材料の結合の役割。
Abstract
磁性粒子を用いた DNA の隔離は、バイオ テクノロジーや分子生物学の研究で重要度の高いフィールドです。このプロトコルでは、動的光散乱 (DL) と電気泳動光散乱 (ELS) を介して結合 DNA 磁性粒子の評価について説明します。DLS による解析は、多分散性、粒径、ゼータ電位を含む粒子の物理化学的性質に関する貴重な情報を提供します。後者は、DNA などの材料の静電結合で主要な役割を果たしている粒子の表面電荷をについて説明します。ここでは、比較分析は、ナノ粒子・微粒子 DNA 結合と溶出への影響の 3 つの化学修飾を悪用します。化学修飾による分岐ポリエチレンイミン、エチル オルトけい酸、(3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシランを調査しました。以来、DNA は負の電荷を展示、DNA の結合に伴う粒子表面のゼータ電位が下がる予定です。クラスターの形成と粒子サイズする必要がありますもに影響します。単独でこれらの粒子の効率性と DNA の溶出を調査するために粒子は低 pH (~ 6)、高イオン強度および脱水環境で DNA と混合されます。磁石の粒子を洗浄し、それから DNA はトリス塩酸バッファーによって溶離される (pH = 8)。DNA コピー数は、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用して推定されます。ゼータ電位と粒径、多分散性および定量的 PCR のデータ評価、比較します。DLS は、洞察力と粒子の DNA の隔離のためのスクリーニングのプロセスに新たな視点を追加する解析法をサポートします。
Introduction
DNA の隔離は、分子生物学の最も重要な手順の 1 つです。核酸の抽出方法の開発ゲノミクス、メタゲノム、エピジェネティクス、トランスクリプトームの新興分野にインパクトもあり。DNA の隔離を含む医療 (法医学/診断ツールと予後バイオ マーカー) のバイオ テクノロジーのアプリケーションおよび環境アプリケーション (メタゲノム生物多様性、病原体の有病率、および監視) の広い範囲があります。浄化し、血液、尿、土、木および他の種類のサンプルなどスケールが異なる、さまざまな材料からの DNA を隔離する需要の増加がずっとあります。1,2,3,4
ナノ ・ マイクロ粒子は、ときに彼らは、磁場によって固定化することができます DNA の隔離と特にその高い表面積のために適しています。粒子サイズや電荷などの物理化学的性質が大きくターゲット生体分子を結合する機能を影響します。5生体分子の結合を強化して粒子を安定させるためには、異なる化学修飾 (表面コーティング) を利用できます。バインドするためのさまざまな方法は、共有と非共有結合性相互作用によると分類されます。6粒子のサイズは、粒子組成は金属、合金の密度、間隙率、および表面に影響を与えることができる他の材料の混入によって合わせることができるに対し、その磁化特性を直接影響します。7小さな粒子の表面電荷を測定する信頼性の高い方法はありません。代わりに、すべり面 (ナノ粒子表面から離れていくつかの距離) で電位が測定できます。8この値ゼータ電位と呼びます通常 DL 経由ナノ ・微粒子の安定性評価に使用される強力なツールです。9その値は pH およびイオン強度の分散環境の粒子の表面特性にだけではなく依存、のでそれも証明できるとの相互作用によって引き起こされるこの表面の変化、粒子および興味の分子。10
その一方で、容易の沈殿物 (集約) 比較した場合によく脱水条件 (A DNA フォーム) 展示圧縮構造の DNA 構造は B DNA フォームを発生しています。静電気 (イオンと水素結合) がその立体アクセス リン酸により他の材料と結合した DNA を制御する主要な力と窒素塩基 (特にグアニン)。7,10
この作品は、磁性ナノ粒子・微粒子の 3 つの代表的な化学修飾の解析 (図 1 a)。合成法とナノ粒子と微粒子の化学修飾、説明します。バインドのソリューションは、DNA の沈殿物 (pH、イオン強度、脱水) の理論的な原理に則したは DNA 結合・溶出評価するた量的な PCR を使用して、代表的なナノ粒子と微粒子 (図 1 b) から dna 溶出効率を評価します。粒径と分散インデックス、ゼータ電位は、粒子表面 (図 1) で発生した物理化学的変化を視覚化するために使用する重要なパラメーターです。磁性粒子表面の化学的性質を強調することが重要です。この手順は、このプロトコルの範囲を超えていた、一方、化学修正の効率を調べるいくつかの近代的な技術を適用できます。11,12,13,14フーリエ変換赤外分光法 (FTIR) は、粒子表面の赤外スペクトルを評価し、無料の化学修飾剤のスペクトルを比較する使用ことができます。X 線光電子分光法 (XPS) は、材料表面の元素組成を識別するために使用することができます別の手法です。微粒子の合成の品質に光を当てる他の電気化学顕微鏡、分光学的方法を使用できます。この作品は、DLS による DNA 磁性粒子の相互作用を分析する新たな視点を強調表示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは磁性粒子のゼータ電位を経由する DNA 結合を説明する理論的な原理は質問の下にあった。プロトコルでは、合成と磁性ナノ粒子・微粒子の変更について説明します。DNA コントロールとバインド溶液の調製法についても述べる。DNA 粒子間相互作用のスクリーニングのため 2 つの戦略がここで表示されます: 量的な PCR と DLS に近づきます。DLS は、粒子の物理化学的変化の 3 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
チェコ科学財団 (プロジェクト GA CR 17 12816S) と CEITEC 2020 (LQ1601) による金融支援は大きく認められています。
Materials
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
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