DNA-Magnetpartikel verbindlich Analyse durch dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von magnetischen Partikeln und Bewertung ihrer DNA-bindende Eigenschaften über dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung. Diese Methode konzentriert sich auf die Überwachung von Änderungen der Partikelgröße, ihre Polydispersität und Zeta-Potential der Partikeloberfläche die spielen wichtige Rolle bei der Bindung von Materialien wie DNA.

Abstract

Isolierung der DNA mit Hilfe magnetischer Partikel ist ein Feld von hoher Bedeutung in der Biotechnologie und Molekularbiologie. Dieses Protokoll beschreibt die Auswertung der DNA-Magnetteilchen über dynamische Lichtstreuung (DLS) und elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) verbindlich. Analyse von DLS liefert wertvolle Informationen über die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel wie Partikelgröße, Polydispersität und Zetapotenzial. Letzterer beschreibt die Oberflächenladung des Teilchens die Hauptrolle in elektrostatische Bindung von Materialien wie DNA spielt. Eine vergleichende Analyse nutzt hier drei chemische Modifikationen von Nanopartikeln und Mikropartikel und ihre Auswirkungen auf die DNA-Bindung und Elution. Chemische Veränderungen durch verzweigte Polyethylenimine, Tetraethylblei Orthosilicate und (3-Aminopropyl) Triethoxysilane untersucht werden. Da DNA eine negative Ladung aufweist, ist zu erwarten, dass Zeta-Potential der Partikeloberfläche bei der Bindung von DNA sinkt. Bildung von Clustern sollte auch Auswirkungen auf die Partikelgröße. Um die Effizienz dieser Partikel isoliert und Elution der DNA zu untersuchen, werden die Partikel mit DNA in niedrigen pH-Wert (~ 6), hohe Ionenstärke und Dehydrierung Umwelt gemischt. Partikel werden auf Magneten gewaschen und dann ist die DNA von Tris-HCl-Puffer eluiert (pH = 8). DNA-Kopienzahl ist anhand quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geschätzt. Zeta-Potential, Partikelgröße, Polydispersität und quantitative PCR-Daten werden ausgewertet und verglichen. DLS ist eine aufschlussreiche und die Unterstützung der Analysemethode, die eine neue Perspektive auf den Prozess der Überprüfung der Partikel für die DNA-Isolierung hinzufügt.

Introduction

DNA-Isolierung ist einer der wichtigsten Schritte in der molekularen Biologie. Die Entwicklung von Nukleinsäure-Extraktionsmethoden hat großen Einfluss auf den aufstrebenden Bereichen Genomik, Metagenomik, Epigenetik und Transkriptom. Es gibt eine Vielzahl von biotechnologischen Anwendungen für die DNA-Isolierung einschließlich medizinische (forensische/Diagnose-Tools und prognostische Biomarker) und Umweltanwendungen (metagenomische Biodiversität, Erreger Prävalenz und Überwachung). Steigende Nachfrage, zu reinigen und DNA zu isolieren, aus verschiedenen Materialien und in unterschiedlichen Maßstäben wie Blut, Urin, Boden, Holz und andere Arten von Proben stattgefunden hat. ^{1 , 2 , 3 , 4}

Und Mikro-Nanopartikel eignen sich für DNA-Isolierung aufgrund ihrer großen Oberfläche und vor allem, wenn sie durch ein Magnetfeld immobilisiert werden können. Physikalisch-chemischen Eigenschaften der Partikel, z. B. Größe oder Ladung, können großen Einfluss auf ihre Fähigkeit, Ziel Biomoleküle zu binden. ⁵ zur weiteren Verbesserung Bindung von Biomolekülen und Partikel zu stabilisieren, können verschiedene chemische Modifikationen (Oberflächenbeschichtung) genutzt werden. Viele verschiedenen Strategien für die Bindung sind nach kovalente und nicht-kovalente Wechselwirkungen klassifiziert. ⁶ die Größe der Partikel wirkt sich direkt auf ihre Magnetisierung Eigenschaften, während Partikelzusammensetzung zugeschnitten werden kann, durch Einbau von Metall, Legierung oder andere Materialien, die Dichte, Porosität und Oberfläche beeinflussen können. ⁷ gibt es keine zuverlässige Möglichkeit, Oberflächenladung kleiner Teilchen zu messen. Stattdessen kann elektrische Potential an das Verrutschen Flugzeug (einiger Entfernung von Nanopartikel-Oberfläche) gemessen werden. ⁸ dieser Wert heißt Zeta potential und es ist ein starkes Werkzeug, die in der Regel für die Bewertung von Nano- und Mikropartikel Stabilität über DLS verwendet wird. ⁹ da sein Wert hängt nicht nur der pH-Wert und die Ionenstärke der dispersive Umwelt, sondern auch auf die Oberflächenbeschaffenheit der Partikel ist, es kann auch zu beweisen die Änderungen in dieser Oberfläche, verursacht durch die Wechselwirkung zwischen den Partikel und Molekül des Interesses. ¹⁰

Auf der anderen Seite vorkommenden DNA-Struktur in trockene Bedingungen (A-DNA Form) Exponate verdichteten Konformationen, die seinen Niederschlag (Aggregation) ermöglichen im Vergleich zu häufig B-DNA-Form. Elektrostatische (Ionische und H-Bindung) sind die wichtigsten Kräfte kontrollieren die Bindung von DNA an anderen Materialien aufgrund ihrer sterisch zugänglich Phosphat und Stickstoff Basen (besonders Guanin). ^{7 , 10}

In dieser Arbeit werden drei repräsentative chemische Modifikationen von magnetischen Nanopartikeln und Mikropartikel analysiert (Abbildung 1A). Die Methode der Synthese und chemische Modifikation von Nanopartikeln und Mikropartikel werden beschrieben. Eine verbindliche Lösung, dieses Abkommen zu theoretischen Grundlagen der DNA Niederschlag (pH-Wert, Ionenstärke und Dehydrierung), wird verwendet, um DNA-Bindung und Elution zu bewerten. Quantitative PCR wird verwendet, um die Effizienz der Elution der DNA aus dem repräsentativen Nanopartikel und Mikropartikel (Abbildung 1 b) bewerten. Partikelgröße, Polydispersität Index und Zetapotenzial sind wichtige Parameter, die verwendet werden, um die physikalisch-chemischen Veränderungen zu visualisieren, die auf der Partikeloberfläche (Abbildung 1) auftreten. Es ist wichtig zu betonen, auf die chemische Charakterisierung der Magnetpartikel Oberfläche. Während dieser Schritt würde den Rahmen dieses Protokolls war, können mehrere moderne Techniken angewendet werden, um die Effizienz der chemischen Veränderungen zu untersuchen. ^{11 , 12 , 13 , 14} Fourier Transform Infrarotspektroskopie (FTIR) lässt sich das Infrarotspektrum der Partikeloberfläche zu bewerten und vergleichen Sie es mit dem Spektrum der freien chemische Modifikatoren. Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) ist eine weitere Technik, die verwendet werden kann, um die elementare Zusammensetzung der Materialoberfläche zu identifizieren. Anderen elektrochemischen, mikroskopische und spektroskopischen Methoden können verwendet werden, die Aufschluss über die Qualität der Partikelsynthese. Diese Arbeit zeigt eine neue Perspektive für die Analyse von DNA-magnetische Partikel Interaktionen über DLS.

Protocol

1. magnetische Nanopartikel-Synthese fügen Sie 20 Mmol FeCl 3 Synthese von magnetischen Nanopartikeln mit Citrat (MNPs) stabilisiert ∙ 6 H 2 O (5,406 g) und 10 Mmol FeCl 2 ∙ 4 H 2 O-(1,988 g) in 20 mL sauerstoffarmes doppelt destilliertes Wasser (Ddd). Rühren, die Lösung kräftig im Becherglas unter N 2 Atmosphäre mit einem mechanischen Rührwerk bis eine transparente Lösung erzielt wird. Unter schnelle …

Representative Results

Über das Protokoll beschriebenen chemischen Synthese und Modifizierung der Magnetpartikel, wurden sechs magnetische Partikel synthetisiert und analysiert für DNA-Bindung. Eine Zusammenfassung der Analyse ist in Tabelle 1dargestellt. Durch den Vergleich der Partikelgröße im Wasser und in verbindliche Lösung, ist es klar, dass alle Partikel in verbindlichen Lösung durch 2-22 Falten aggregiert. Einige Partikel weiter zu mehr Falten im Beisein von DNA aggregiert; jedoch…

Discussion

In diesem Protokoll wurden die theoretischen Grundlagen, die DNA-Bindung an Magnetpartikel über das Zetapotenzial erklären in Frage gestellt. Das Protokoll beschreibt die Synthese und Modifizierung von magnetischen Nanopartikeln und Mikropartikel. Methode für die Erstellung von DNA-Kontrolle und verbindliche Lösung werden ebenfalls beschrieben. Zwei Strategien sind hier für das Screening der DNA-Partikel-Wechselwirkungen gezeigt: quantitative PCR und DLS nähert. DLS bietet drei Indikatoren für die physikalisch-che…

Materials

Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	207926	Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	380024	Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8263	Magnetic particle synthesis
Acetone	Penta	10060-11000	Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	W302600	Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate	Sigma-Aldrich	131903	Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228-M	Magnetic particle synthesis
Ethanol	Penta	71250-11000	Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate	Sigma-Aldrich	P6083	Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.05012	Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)	Spectrum labs	G235063	Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer	witeg Labortechnik GmbH	DH.WOS01035	Magnetic particle synthesis
Waterbath	Memmert GmbH + Co.	84198998	Magnetic particle synthesis
Sonicator	Bandelin	795	Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell	Malvern	DTS1070	Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit	Sigma-Aldrich	QR0100	PCR kit
Mastercycler pro S instrument	Eppendorf	6325 000.013	Thermocycler
MinElute kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S7670	DNA binding