动态和电泳光散射的 DNA-磁性颗粒结合分析
Summary
该协议描述了磁性粒子的合成, 并通过动态和电泳光散射对其 DNA 结合特性进行了评价。该方法着重于监测粒子大小的变化, 它们的多和粒子表面的泽塔电位, 它们在 DNA 等材料的结合中起着重要作用。
Abstract
利用磁性微粒分离 DNA 是生物技术和分子生物学研究的一个重要领域。本协议描述了通过动态光散射 (dl) 和电泳光散射 () 对 DNA 磁粒子结合的评价。dl 的分析提供了关于粒子的物理化学性质的有价值的信息, 包括颗粒大小, 多, 和泽塔电位。后者描述了粒子的表面电荷, 它在 DNA 等材料的静电结合中起主要作用。在这里, 比较分析利用三化学修饰纳米微粒和微粒及其对 DNA 结合和洗脱的影响。研究了分枝亚、四乙基硅酸和 (3-氨基丙氨) 烷的化学修饰。由于 dna 呈负电荷, 因此预期粒子表面的泽塔电位会随着 dna 的结合而减少。簇的形成也会影响粒子的大小。为了研究这些微粒在 dna 分离和洗脱中的效率, 在低 pH 值 (约 6)、高离子强度和脱水环境中, 颗粒与 dna 混合。粒子被用磁铁洗涤, 然后 DNA 被洗的三盐酸缓冲 (pH 值 = 8)。用定量聚合酶链反应 (PCR) 估计 DNA 拷贝数。对其电位、粒径、多和定量 PCR 数据进行了评价和比较。dl 是一种有洞察力和支持性的分析方法, 为 DNA 分离的微粒筛选过程增添了新的视角。
Introduction
DNA 分离是分子生物学中最重要的步骤之一。核酸提取方法的发展对基因组学、基因、遗传学和转录等新兴领域产生了巨大的影响。有广泛的生物技术应用的 DNA 隔离, 包括医学 (法医/诊断工具和预后的生物标志), 和环境应用 (基因多样性, 病原体的流行, 和监测)。从不同的材料和不同的尺度, 如血液、尿液、土壤、木材和其他种类的样品, 对 DNA 进行纯化和分离的需求越来越大。1,2,3,4
纳米和微米粒子适用于 DNA 的分离, 因为它们的表面积很高, 特别是当它们可以被磁场固定时。颗粒的物理化学性质, 如大小或电荷, 会极大地影响它们对靶生物分子的束缚能力。5为了进一步增强生物分子的结合力和稳定粒子, 可以利用不同的化学修饰 (表面涂层)。根据共价键和价的相互作用, 对多种不同的结合策略进行分类。6粒子的大小直接影响其磁化特性, 而颗粒成分可以通过加入金属、合金或其他能影响其密度、孔隙度和表面的材料来定制。7没有可靠的方法来测量小颗粒的表面电荷。相反, 在滑移面上的电势 (离纳米颗粒表面的距离) 可以测量。8此值称为 “泽塔电位”, 它是一种有效的工具, 通常用于通过 dl 评估纳米和微粒的稳定性。9因为它的值不仅高度依赖于色散环境的 pH 和离子强度, 而且还依赖于粒子的表面特性, 它还可以证明这一表面的变化引起的相互作用粒子和分子的兴趣。10
另一方面, 在脱水条件下的 dna 结构 (A-dna 形式) 表现出致密的构象, 以利于其沉淀 (聚集) 与一般发生的 B dna 形式相比。静电 (离子和 H 键) 是控制 DNA 与其他物质结合的主要力量, 这是由于它们阻的磷酸盐和氮碱 (特别是鸟嘌呤)。7,10
在这项工作中, 对磁性纳米微粒和微粒的三有代表性的化学修饰进行了分析 (图 1A)。介绍了纳米微粒和微粒的合成和化学改性方法。结合 dna 沉淀 (pH 值、离子强度和脱水) 的理论原理, 用于评价 dna 结合和洗脱的方法。采用定量 PCR 技术对具有代表性的纳米微粒和微粒 (图 1B) DNA 的洗脱效率进行了评价。粒子大小、多指数和泽塔电位是用于可视化粒子表面物理化学变化 (图 1C) 的重要参数。强调磁性粒子表面的化学特性是很重要的。虽然这一步骤超出了本议定书的范围, 但可以应用一些现代技术来调查化学修饰的效率。11,12,13,14傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 可用于评价粒子表面的红外光谱, 并与自由化学修饰剂的光谱进行比较。x 射线光电子能谱 (XPS) 是另一种可用于识别材料表面元素组成的技术。其他的电化学、显微和光谱方法可以用来揭示粒子合成的质量。这项工作突出了一个新的角度来分析 DNA 磁性粒子的相互作用通过 dl。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这个协议中, 解释 DNA 与磁性粒子通过齐塔人的电位结合的理论原理是有问题的。该协议描述了磁性纳米微粒和微粒的合成和修饰。文中还介绍了制备 DNA 控制和结合液的方法。这里显示了两种筛选 DNA-粒子相互作用的策略: 定量 PCR 和 dl 方法。dl 提供了三指标的物理化学变化的粒子: 颗粒大小, 多指数和泽塔电位。颗粒大小的变化直接表明聚合或解体。多指数值描述了从分散 (指数和 #60; 0.05) 到高…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
捷克科学基金会 (项目 GA CR 17-12816S) 和 CEITEC 2020 (LQ1601) 的财政支持得到了极大的认可。
Materials
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
- Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
- Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
- Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
- Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
- Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
- Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
- Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
- Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
- Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
- Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
- Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
- Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
- Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
