Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

Summary

Este protocolo describe la síntesis de partículas magnéticas y evaluación de sus propiedades de unión al ADN mediante dispersión de luz dinámica y electroforética. Este método se centra en monitorear los cambios en el tamaño de las partículas, su polidispersidad y potencial zeta de superficie de la partícula que juegan importante papel en el atascamiento de materiales como el ADN.

Abstract

Aislamiento de ADN utilizando partículas magnéticas es un campo de gran importancia en la investigación de biotecnología y biología molecular. Este protocolo describe la evaluación de las partículas magnéticas de DNA de enlace vía dispersión ligera dinámica (DLS) y dispersión de la luz electroforética (ELS). Análisis por DLS ofrece valiosa información sobre las propiedades fisicoquímicas de las partículas incluyendo tamaño de partícula, polidispersidad y potencial zeta. Este último describe la carga superficial de la partícula que juega papel importante en la Unión electrostática de materiales como el ADN. Aquí, un análisis comparativo explota tres modificaciones químicas de nanopartículas y micropartículas y sus efectos sobre la Unión de ADN y elución. Modificaciones químicas por ramificaron polietilenimina, Tetraetilo ortosilicato y (3-aminopropil) trietoxisilano son investigados. Puesto que el ADN exhibe una carga negativa, se espera que potencial zeta de superficie de la partícula disminuye al atascamiento de la DNA. Formación de clusters debe afectar también a tamaño de partícula. Para investigar la eficacia de estas partículas en el aislamiento y la elución de la DNA, las partículas se mezclan con el ADN en pH bajo (~ 6), la alta fuerza iónica y el ambiente de la deshidratación. Se lavan las partículas de imán y luego ADN es eluido por tampón Tris-HCl (pH = 8). Número de copias de ADN se estima usando la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (PCR). Tamaño de partícula, potencial zeta y datos cuantitativos de PCR, polidispersidad se evaluó y se comparó. DLS es una perspicaz y método de análisis que agrega una nueva perspectiva para el proceso de proyección de partículas de ADN de apoyo.

Introduction

Extracción de ADN es uno de los pasos más esenciales en biología molecular. El desarrollo de métodos de extracción de ácidos nucleicos tiene gran impacto en los campos emergentes de la genómica, la metagenómica, la epigenética y la transcriptómica. Hay una amplia gama de aplicaciones biotecnológicas para el aislamiento de la DNA incluyendo médicos (herramientas forenses y diagnóstico y pronóstico) y aplicaciones medioambientales (diversidad biológica de la metagenómica, prevalencia del patógeno y vigilancia). Ha habido una creciente demanda para purificar y aislar ADN de diversos materiales y en diferentes escalas como sangre, orina, tierra, madera y otros tipos de muestras. ^{1 , 2 , 3 , 4}

Partículas de tamaño nano y micro son convenientes para el aislamiento de ADN debido a su alta área superficial y, en particular cuando puede ser inmovilizados por un campo magnético. Propiedades fisicoquímicas de las partículas, tales como tamaño o carga, pueden influir mucho su capacidad objetivo biomoléculas. ⁵ para mejorar aún más la Unión de biomoléculas y estabilizar las partículas, se pueden utilizar diferentes modificaciones químicas (capas superficiales). Las muchas estrategias diferentes para el atascamiento se clasifican según las interacciones covalentes y no covalentes. ⁶ el tamaño de las partículas afecta directamente a sus propiedades de magnetización, considerando que la composición de partículas puede ser adaptado por la incorporación de metal, aleación u otros materiales que pueden influir en su densidad, porosidad y superficie. ⁷ hay no hay manera confiable para medir la carga superficial de las partículas pequeñas. En cambio, se puede medir potencial eléctrico en el plano de deslizamiento (lejos de superficie de nanopartículas). ⁸ este valor se llama zeta potencial y es una potente herramienta que se utiliza generalmente para la evaluación de estabilidad de nano y micropartículas por DLS. ⁹ puesto que su valor depende no sólo el pH y fuerza iónica del medio dispersivo, sino también en las características superficiales de las partículas, puede también probar los cambios en esta superficie causado por la interacción entre el partículas y moléculas de interés. ¹⁰

Por otra parte, estructura del ADN en condiciones deshidratado (forma A-ADN) exposiciones conformaciones compactada que facilitan su precipitación (agregación) en comparación a comúnmente ocurriendo forma de B-DNA. Electrostática (iónico y el enlace H) son las principales fuerzas controlando el atascamiento de la DNA a otros materiales debido a su accesible sterically fosfato y nitrógeno bases (sobre todo guanina). ^{7 , 10}

En este trabajo se analizan tres modificaciones químicas representativas de nanopartículas magnéticas y micropartículas (figura 1A). Se describen el método de síntesis y modificación química de nanopartículas y micropartículas. Una solución vinculante, acuerdos de principios teóricos de la precipitación de ADN (pH, fuerza iónica y deshidratación) se utiliza para evaluar la elución y atascamiento de la DNA. PCR cuantitativa se utiliza para evaluar la eficacia de la elución de la DNA de la representante de nanopartículas y micropartículas (figura 1B). Granulometría, índice de polidispersidad y potencial zeta son parámetros importantes que se utilizan para visualizar los cambios fisicoquímicos que ocurren en la superficie de la partícula (figura 1). Es importante destacar en la caracterización química de la superficie de la partícula magnética. Mientras que este paso era más allá del alcance de este protocolo, pueden aplicarse varias técnicas modernas para investigar la eficacia de modificaciones químicas. ^{11 , 12 , 13 , 14} espectroscopia de infrarrojo de transformación de Fourier (FTIR) puede utilizarse para evaluar el espectro infrarrojo de la superficie de la partícula y se compara con el espectro de modificadores químicos gratis. Espectroscopía de fotoelectrones de rayos x (XPS) es otra técnica que puede utilizarse para identificar la composición elemental de la superficie del material. Pueden utilizar otros métodos electroquímicos, microscópicas y espectroscópicas para arrojar luz sobre la calidad de síntesis de partículas. Este trabajo pone de relieve una nueva perspectiva para el análisis de ADN magnético interacciones de partículas a través de DLS.

Protocol

1. síntesis de nanopartículas magnéticas síntesis de nanopartículas magnéticas estabilizan con citrato (MNPs) Añadir 20 mmol de FECLAS 3 ∙ 6 H 2 O (5,406 g) y 10 mmol de FECLAS 2 ∙ 4 H 2 O (1,988 g) en 20 mL de agua bidestilada desoxigenada (agua de ddd). Revuelva obtenida la solución vigorosamente en vaso bajo atmósfera de N 2 con un agitador mecánico hasta obtener una solución transparente. Bajo …

Representative Results

Utilizando el protocolo descrito aquí para síntesis química y la modificación de las partículas magnéticas, seis partículas magnéticas se sintetiza y se analizaron para el atascamiento de la DNA. Un resumen del análisis se muestra en la tabla 1. Comparando el tamaño de las partículas en el agua y en la solución de Unión, es claro que todas las partículas de agregaron en enlace solución por pliegues 2-22. Algunas partículas más agregan a más pliegues en l…

Discussion

En el presente Protocolo, los principios teóricos que explican la Unión de ADN a las partículas magnéticas vía potencial zeta estaban bajo pregunta. El protocolo describe la síntesis y modificación de nanopartículas magnéticas y micropartículas. También se describen el método para la preparación de la solución de control y enlace de ADN. Aquí se muestran dos estrategias para la detección de interacciones de partículas de ADN: PCR cuantitativa y DLS se acerca. DLS ofrece tres indicadores de cambios fisico…

Materials

Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	207926	Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	380024	Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8263	Magnetic particle synthesis
Acetone	Penta	10060-11000	Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	W302600	Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate	Sigma-Aldrich	131903	Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228-M	Magnetic particle synthesis
Ethanol	Penta	71250-11000	Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate	Sigma-Aldrich	P6083	Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.05012	Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)	Spectrum labs	G235063	Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer	witeg Labortechnik GmbH	DH.WOS01035	Magnetic particle synthesis
Waterbath	Memmert GmbH + Co.	84198998	Magnetic particle synthesis
Sonicator	Bandelin	795	Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell	Malvern	DTS1070	Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit	Sigma-Aldrich	QR0100	PCR kit
Mastercycler pro S instrument	Eppendorf	6325 000.013	Thermocycler
MinElute kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S7670	DNA binding