En enkel och effektiv metod för In Vivo hjärt-specifik gen Manipulation av Intramyocardial injektion i möss
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för manipulering av hjärt-specifika genen i möss. Under anestesi, var mus hjärtan externalized via den fjärde interkostalrummet. Därefter blot adenoviruses kodning specifika gener skulle injiceras med en spruta i myokardiet, följt av protein uttryck mätning via i vivo imaging och Western analys.
Abstract
Gen manipulation specifikt i hjärtat potentiera betydligt utredning av hjärtsjukdom patomekanism och deras terapeutiska potential. In vivo hjärt-specifik gen leverans uppnås vanligen genom antingen systemiska eller lokala leverans. Systemisk injektion via svans ven är enkel och effektiv i att manipulera hjärt genuttryck med hjälp av rekombinant adeno-associerade virus 9 (AAV9). Men denna metod kräver en relativt hög mängd vektor för effektiv transduktion och kan resultera i ickemålorganismer orgel gen transduktion. Här beskriver vi en enkel, effektiv och tidsbesparande metod för intramyocardial injektion av i vivo hjärt-specifik gen manipulation hos möss. Under anestesi (utan ventilation), större och mindre bröstmusklerna var rakt på sak dissekeras och mus hjärtat utsattes snabbt av manuell externalisering genom ett litet snitt på den fjärde interkostalrummet. Därefter, injicerades adenovirus kodning luciferas (Luc) och vitamin D-receptorn (VDR), eller kort hårnål RNA (shRNA) inriktning VDR, med en Hamilton spruta i myokardiet. Efterföljande i vivo imaging visade att luciferas var framgångsrikt överuttryckt specifikt i hjärtat. Dessutom bekräftade Western blot analys den framgångsrika överuttryck eller Tystande av VDR i mus hjärtat. När behärskar, kan denna teknik användas för genen manipulation, liksom injektion av celler eller andra material, såsom nanogels i mus hjärtat.
Introduction
Hjärtsjukdom är den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet i hela världen1,2. Bristen på effektiva behandlingsstrategier för livshotande hjärtproblem inklusive hjärtinfarkt och hjärtsvikt lockar intensiv utforskning av underliggande patomekanism och identifiering av nya terapeutiska alternativ3. För dessa vetenskapliga expeditioner är hjärt-specifik gen manipulation utbredda4,5. Hjärt gen manipulation kan uppnås genom gen editering med hjälp av den kraftfulla transkription aktivator-liknande effektor nuclease (TALEN) och klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) / CRISPR associerade protein 9 (Cas9) verktyg, eller genom leverans av ektopisk genetiska material (t.ex., virusvektorer bära gener som kodar för proteiner av intresse)6. Om gen editering tillåter exakt och spatiotemporal genomet ändringar i levande möss, är det fortfarande en tidskrävande och arbetsintensiva praktiken6. Hjärt-specifik gen manipulation av viruset vektor- eller små störande RNA (siRNA) komplex leverans är rutinmässigt utförs alternativt6.
Viruset vektor leverans till vuxen mus hjärtat uppnås genom ungefär två strategier: systemisk eller lokal injektion. Systemisk injektion av medel serotyp av AAVs såsom AAV9 är noninvasiv för hjärt specifik gen manipulation7. Denna metod kräver en relativt hög mängd vektor nödvändig för effektiv transduktion och genuttryck, vilket kan resultera i betydande transduktion i ickemålorganismer organ såsom muskler och levern7. Lokala virus injektion uppnås genom intramyocardial injektion eller intracoronary leverans7. Intracoronary leverans leder till en jämnare fördelning av virus inom hjärtat jämfört med intramyocardial injektion. Nackdelarna med denna teknik är dock den snabba wash-out av virala vektorer till systemcirkulationen och transduktion i ickemålorganismer organ8och dess krav på anordningar för mätning under operationen. Däremot vektor intramyocardial injektion möjliggör bättre virus lagring i hjärtmuskeln samt platsspecifika leverans, men det misslyckas att jämnt fördela viral7. För små djur är intracoronary leverans tekniskt svåra att utföra, medan systemisk AAV9 injektering och intramyocardial är mer allmänt praktiseras4,5,7. Även systemisk injektion är enkelt att utföra, konventionella intramyocardial injektion kräver mekanisk ventilation och torakotomi, orsakar omfattande vävnadsskada, och är tidskrävande.
I denna rapport beskrev vi en lätt, sparar tid och mycket effektiv metod för intramyocardial injektion. Adenovirus kodning luciferas och VDR eller shRNA inriktning VDR, injicerades för att manipulera hjärt genuttryck. När behärskar, kan denna metod användas för genen manipulation, liksom injektion av celler eller andra material i mus hjärtat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den aktuella rapporten visar en modifierad teknik för intramyocardial injektion av virala vektorer för hjärt gen manipulation, som ändrades från en metod för hjärtinfarkt induktion av Gao et al. 13 för närvarande i vivo karakterisering av specifik gen funktioner oftast innebär framtagning av knockout eller transgena möss3,14,15,16,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Science Fund för framstående unga forskare (81625002), National Natural Science Foundation Kina (81470389, 81270282, 81601238), Program för Shanghai akademiska forskningsledare (18XD1402400), Shanghai Municipal Utbildning kommissionen Gaofeng klinisk medicin bidragsstöd (20152209), Shanghai Shenkang sjukhus Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 och 14XJ10019), Shanghai segling Program (18YF1413000), och forskarutbildning innovationsprogram av Bengbu Medical College (Byycx1722). Vi tackar Dr. Erhe Gao för hans tidigare hjälp i vårt labb.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
