Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.
Abstract
Genmanipulation speziell im Herzen deutlich potenzieren die Untersuchung von Herzerkrankungen Pathomechanismen und ihr Therapeutisches Potenzial. In Vivo Herz-spezifischen gen-Lieferung wird häufig durch systemische oder lokale Lieferung erreicht. Systemische Injektion über Heck Vene ist einfach und effizient bei der Manipulation von kardialen Genexpression mittels rekombinantes Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9). Jedoch diese Methode erfordert einen relativ hohen Anteil an Vektor für effizienten Transduktion und Energiesubventionen Orgel gen Transduktion führen kann. Hier beschreiben wir eine einfache, effiziente und zeitsparende Methode des Intramyocardial Injektion für in Vivo Herz-spezifischen gen-Manipulation bei Mäusen. Unter Anästhesie (ohne Lüftung) Dur und Moll Brustmuskeln waren unverblümt seziert und Maus Herzen wurde schnell durch manuelle Externalisierung durch einen kleinen Schnitt an der vierten intercostalneuralgie Raum ausgesetzt. Anschließend wurde Adenovirus Codierung Luciferase (Luc) und Vitamin-D-Rezeptor (VDR) oder kurze Hairpin RNA (ShRNA) gezielt VDR, mit einer Spritze Hamilton in der Herzmuskel injiziert. Nachfolgende in-Vivo Bildgebung gezeigt, dass Luciferase erfolgreich überexprimieren, speziell im Herzen war. Western-Blot Analyse im übrigen bestätigt die erfolgreiche Überexpression oder Schweigen der VDR im Herzen Maus. Einmal gemeistert, kann diese Technik für Genmanipulation sowie Injektion von Zellen oder anderen Materialien wie Nanogels im Herzen Maus verwendet werden.
Introduction
Herzerkrankung ist die häufigste Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit1,2. Der Mangel an effektiven Therapiestrategien für lebensbedrohlichen Herzerkrankungen wie Herzinfarkt und Herzinsuffizienz zieht intensive Auseinandersetzung des zugrunde liegenden Pathomechanismen und Identifikation von neuartigen therapeutischen Optionen3. Für diese wissenschaftliche Erkundungen ist Herz-Kreislauf-spezifischen Genmanipulation weit verbreiteten4,5. Kardiale Genmanipulation von Genom-Bearbeitung mit Hilfe der leistungsfähigen Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nuklease (TALEN) erreicht werden und regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) gruppierten / CRISPR assoziierten Protein 9 (Cas9) Werkzeuge, oder durch Lieferung von ektopische genetischen Materials (z.B. Virus Vektoren mit Genen Codierung interessierender Proteine)6. Wenn Genom-Bearbeitung präziser und raumzeitlichen Genom Änderungen in lebenden Mäusen ermöglicht, ist es immer noch eine zeitraubende und arbeitsintensive Praxis6. Alternativ, Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation durch Virus Vektor oder kleine störende RNA (SiRNA) komplexe Lieferung werden routinemäßig durchgeführt6.
Virus Vektor Lieferung an die Erwachsenen Maus Herz wird erreicht, indem etwa zwei Strategien: systemische oder lokale Injektion. Systemische Injektion Cardiotropic Serotyp des Flugabwehrpanzer wie AAV9 ist nicht-invasive kardiale spezifisches gen-Manipulation-7. Jedoch diese Methode erfordert einen relativ hohen Anteil an Vektor für effiziente Signaltransduktion und Genexpression notwendig, und kann zu erheblichen Transduktion von Energiesubventionen Organen wie Muskeln und Leber7führen. Lokalen Virus Injektion wird durch Intramyocardial Injektion oder intracoronary Lieferung7erreicht. Intracoronary Lieferung führt zu einer gleichmäßigeren Verteilung des Virus innerhalb des Herzens im Vergleich zu Intramyocardial Injektion. Die Nachteile dieser Technik sind jedoch die schnelle Auswaschen von viralen Vektoren auf die systemische Zirkulation und Transduktion in Energiesubventionen Organe8und die Anforderung von Geräten für die Druckmessung während der Operation. Im Gegensatz dazu Vektor Intramyocardial Injektion ermöglicht bessere Virus Retention in den Herzmuskel sowie ortsspezifische Lieferung, aber es versäumt, virale verteilen-7. Für Kleintiere ist intracoronary Lieferung technisch schwierig, ausführen, während systemische AAV9 Injektion und Intramyocardial Injektion häufiger praktizierte4,5,7 sind. Obwohl systemische Injektion leicht durchzuführen ist, herkömmliche Intramyocardial Injektion erfordert mechanische Lüftung und Thorakotomie verursacht umfangreiche Gewebeschäden und ist zeitaufwendig.
In diesem Bericht beschrieben, eine einfache, zeitsparende und hocheffiziente Methode für die Intramyocardial Injektion. Adenovirus Codierung Luciferase und VDR oder ShRNA targeting VDR, injiziert wurde, um kardialen Genexpression zu manipulieren. Einmal gemeistert, kann diese Methode für Genmanipulation sowie Injektion von Zellen oder anderen Materialien im Herzen Maus verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der vorliegende Bericht zeigt eine modifizierte Technik für die Intramyocardial Injektion von viralen Vektoren für kardiale Genmanipulation, die von einer Methode für die myokardiale Infarktbildung Induktion von Gao Et Al. geändert wurde 13 derzeit in Vivo Charakterisierung von spezifischen Genfunktionen in den meisten Fällen beinhalten die Erzeugung von Knockout oder Transgene Mäuse3,14,<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Nationalfonds für aufstrebenden jungen Gelehrten (81625002), National Natural Science Foundation of China (81470389, 81270282, 81601238), Programm von Shanghai Academic Research Leader (18XD1402400), Shanghai Municipal unterstützt. Bildung Kommission Gaofeng klinische Medizin Zuschüsse (20152209), Shanghai Shenkang Krankenhaus Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 und 14XJ10019), Shanghai-Segel-Programm (18YF1413000) und postgraduale Innovationsprogramm des Bengbu Medical College (Byycx1722). Wir danken Dr. Erhe Gao für seine früheren Hilfe in unserem Labor.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
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