Un metodo semplice ed efficace per In Vivo manipolazione del Gene specifico tramite l'iniezione intramiocardica in topi

Summary

Qui presentiamo un protocollo per la manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia, i cuori di topo sono stati esternalizzati attraverso il quarto spazio intercostale. Successivamente, gli adenovirus codifica specifici geni sono stati iniettati con una siringa nel miocardio, seguito dalla misura di espressione della proteina in vivo imaging e Western blot analisi.

Abstract

Manipolazione del gene specificamente nel cuore potenziare significativamente l'inchiesta di malattia cardiaca pathomechanisms e loro potenziale terapeutico. In vivo consegna specifico gene comunemente viene ottenuta tramite consegna o sistemica o locale. Iniezione sistemica tramite vena caudale è facile ed efficiente nel manipolare l'espressione genica cardiaca utilizzando virus adeno-associato ricombinante 9 (AAV9). Tuttavia, questo metodo richiede una quantità relativamente elevata di vettore per la trasduzione efficiente e può provocare la trasduzione del gene di organo del nontarget. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e risparmio di tempo di iniezione intramiocardica per in vivo manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia (senza ventilazione), senza mezzi termini sono stati sezionati i muscoli pettorali maggiori e minori, e il cuore del topo è stato rapidamente esposti dal manuale esternalizzazione attraverso una piccola incisione presso il quarto spazio intercostale. Successivamente, l'adenovirus codifica luciferasi (Luc) e del recettore della vitamina D (VDR) o short hairpin RNA (shRNA) VDR, il targeting è stato iniettato con una siringa Hamilton nel miocardio. Successivi in vivo imaging ha dimostrato che quel luciferase era correttamente overexpressed in particolare nel cuore. Inoltre, l'analisi Western blot ha confermato la sovraespressione di successo o silenziamento di VDR nel cuore del mouse. Una volta imparato, questa tecnica può essere utilizzata per la manipolazione del gene, così come l'iniezione di cellule o di altri materiali quali nanogel nel cuore del mouse.

Introduction

La malattia cardiaca è la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo^1,2. La mancanza di strategie terapeutiche efficaci per circostanze life-threatening di cuore compreso l'infarto miocardico e insufficienza cardiaca attira intensa esplorazione di pathomechanisms sottostante e l'identificazione di nuove opzioni terapeutiche³. Per queste esplorazioni scientifiche, manipolazione del gene specifico è ampiamente usato^4,5. Manipolazione del gene cardiaco può essere ottenuta utilizzando la nucleasi di attivatore-come ....

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo gli istituti nazionali di salute orientamenti sull'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato di etica degli animali dell'Istituto. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschii di C57BL/6J (8-10 settimane di età). Topi sono stati alloggiati in condizioni esenti da patogeni a 24 ° C ± 4 ° C, con un ciclo luce/buio di 12 h, con libero accesso all'acqua e cibo.

1. preparazione della soluzione di Adenovirus

1. All'arrivo della soluzione purificata dell'adenovirus, conservare la soluzione in un congelatore a-80 ° C.
   Nota: L'iniezione ....

Results

Il protocollo di esperimento e alcuni dei passaggi chiavi per il metodo segnalato sono mostrati nella Figura 1. 5 giorni dopo l'iniezione intramiocardica di luciferasi codifica dell'adenovirus (Adv-luc), in vivo imaging in adv-luc iniettato topi indicato robusta sovraespressione di luciferasi specificamente nel cuore (Figura 2A, B), che era confermato da analisi Western blot (Figura .......

Discussion

Il rapporto attuale dimostra una tecnica modificata per iniezione intramiocardica di vettori virali per la manipolazione del gene cardiaco, che è stato modificato da un metodo per l'induzione di infarto miocardico da Gao et al. ¹³ attualmente, in vivo caratterizzazione delle funzioni dei geni specifici più spesso coinvolgono la generazione di Ko o topi transgenici^3,14,15,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attrezzature
Cappa sterile a flusso laminare	Fengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, Cina)	FS-CJ-2F
Centrifuga	Thermo Scientific (Waltham, USA)	75005282
Macinatrice per tessuti	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, Cina)	Scientz-48
Sterilizzatore ad alta temperatura/alta pressione	Hirayama (Saitama, Giappone)	HVE-50
Vaporizzatore isoflurano	Matrix (Orchard Park, Stati Uniti)	VIP3000
IVIS  Sistema di imaging Lumina III	PerkinElmer (Waltham, USA)	CLS136334
Precision  equilibrio	Sartorius (Gö ttingen, Germania)	28091873
Instruments
Eppendorf pipetta (100 &; micro; L)	Eppendorf (Westbury, Stati Uniti)
pipetta Eppendorf (10 & micro; L)	Eppendorf (Westbury, Stati Uniti)
Forcipe	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	JD4020
Siringa Hamilton	Hamilton (Nevada, USA)	80501	Volume 50 μ L
Emostatico Micro-zanzara	F.S.T (Foster City, USA)	13011-12	Curvo, larghezza punta 1,3 mm
Porta aghi	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, Cina)	J32110
Forbici chirurgiche	F.S.T (Foster City, USA)	14002-12
Siringa da 1 ml	WeiGao Group Medical Polymer Co., Ltd. (ShangDong, Cina)
Materiali e reagenti
Anti-GAPDH	anticorpo CST (Danvers,  USA)	#2118
Anticorpo anti-luciferasi	Abcam (Cambridge, Regno Unito)	ab187340
Anti-coniglio IgG	CST (Danvers,  USA)	#7074
Anticorpo anti-VDR	Abcam (Cambridge, Regno Unito)	ab109234
Buprenorfina	Thermo Scientific (Waltham, USA)	PA175056
Idre cloraliche	LingFeng Chemical (ShangHai, Cina)
Fiale criogeniche	Thermo Scientific (Waltham, USA)	375418	1,8 ml
Crema depilatoria	Veet (Shanghai, Cina)
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Gibco (Grand Island,  USA)	14040133
Entoiodine	LiKang (Shanghai, Cina)	310132
tubo EP	Sarstedt (Newton, USA)	PCR001
Filtro	Millipore (Bedford, USA)		Dimensione dei pori 0,2 e micro; m
Isoflurano	Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, Cina)
Luciferin	Promega (Madison, USA)	P1041
Tampone di lisi per western blot	Beyotime (Shanghai, Cina)	P0013J	Senza inibitori
Crema oftalmica	Apex Laboratories (Melbourne, Australia))
PBS	Gibco (Grand Island,  USA)	10010023
Cocktail di inibitori della proteasi	Thermo Scientific (Waltham, USA)	78438
Sutura di seta 5-0	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, Cina)
Sfera d'acciaio	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, Cina)		Larghezza 1,5 mm
Ago per siringa	Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, Cina)		Calibro 30
Tappetino caldo	Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, Cina)	NF-GNCW