Un metodo semplice ed efficace per In Vivo manipolazione del Gene specifico tramite l'iniezione intramiocardica in topi
Summary
Qui presentiamo un protocollo per la manipolazione del gene specifico in topi. Nell’ambito dell’anestesia, i cuori di topo sono stati esternalizzati attraverso il quarto spazio intercostale. Successivamente, gli adenovirus codifica specifici geni sono stati iniettati con una siringa nel miocardio, seguito dalla misura di espressione della proteina in vivo imaging e Western blot analisi.
Abstract
Manipolazione del gene specificamente nel cuore potenziare significativamente l’inchiesta di malattia cardiaca pathomechanisms e loro potenziale terapeutico. In vivo consegna specifico gene comunemente viene ottenuta tramite consegna o sistemica o locale. Iniezione sistemica tramite vena caudale è facile ed efficiente nel manipolare l’espressione genica cardiaca utilizzando virus adeno-associato ricombinante 9 (AAV9). Tuttavia, questo metodo richiede una quantità relativamente elevata di vettore per la trasduzione efficiente e può provocare la trasduzione del gene di organo del nontarget. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e risparmio di tempo di iniezione intramiocardica per in vivo manipolazione del gene specifico in topi. Nell’ambito dell’anestesia (senza ventilazione), senza mezzi termini sono stati sezionati i muscoli pettorali maggiori e minori, e il cuore del topo è stato rapidamente esposti dal manuale esternalizzazione attraverso una piccola incisione presso il quarto spazio intercostale. Successivamente, l’adenovirus codifica luciferasi (Luc) e del recettore della vitamina D (VDR) o short hairpin RNA (shRNA) VDR, il targeting è stato iniettato con una siringa Hamilton nel miocardio. Successivi in vivo imaging ha dimostrato che quel luciferase era correttamente overexpressed in particolare nel cuore. Inoltre, l’analisi Western blot ha confermato la sovraespressione di successo o silenziamento di VDR nel cuore del mouse. Una volta imparato, questa tecnica può essere utilizzata per la manipolazione del gene, così come l’iniezione di cellule o di altri materiali quali nanogel nel cuore del mouse.
Introduction
La malattia cardiaca è la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo1,2. La mancanza di strategie terapeutiche efficaci per circostanze life-threatening di cuore compreso l’infarto miocardico e insufficienza cardiaca attira intensa esplorazione di pathomechanisms sottostante e l’identificazione di nuove opzioni terapeutiche3. Per queste esplorazioni scientifiche, manipolazione del gene specifico è ampiamente usato4,5. Manipolazione del gene cardiaco può essere ottenuta utilizzando la nucleasi di attivatore-come effettore potente trascrizione (TALEN) l’editing genomico e cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) / CRISPR associated protein 9 (Cas9) strumenti, o di consegna del materiale genetico ectopici (ad es., vettori del virus portatori di geni che codificano per le proteine di interesse)6. Se l’editing genomico permette modifiche precise e spaziotemporali genoma in topi vivi, è ancora una pratica molto tempo e laborioso6. In alternativa, la manipolazione del gene specifico di vettore del virus o interferire piccolo consegna complesso RNA (siRNA) sono regolarmente eseguita6.
Consegna di vettore di virus nel cuore di topo adulto è raggiunto da circa due strategie: iniezione sistemica o locale. Iniezione sistemica di cardiotropi sierotipo di adenoassociati come AAV9 è non invadente per gene specifico cardiaco manipolazione7. Tuttavia, questo metodo richiede una quantità relativamente alta di vettore necessarie per trasduzione efficiente e l’espressione genica e può provocare significative trasduzione del nontarget organi quali il muscolo e fegato7. Iniezione di virus locale avviene mediante iniezione intramiocardica o intracoronary consegna7. Consegna intracoronary conduce ad una distribuzione più uniforme del virus all’interno del cuore rispetto all’iniezione intramiocardica. Tuttavia, gli svantaggi di questa tecnica sono il lavaggio rapido fuori di vettori virali per la circolazione sistemica e la trasduzione in organi del nontarget8e relativo requisito di dispositivi per la misurazione della pressione durante il funzionamento. Al contrario, consente di iniezione intramiocardica migliore ritenzione del virus nel miocardio nonché consegna sito specifico, ma non riesce a distribuire uniformemente virale vettore7. Piccoli animali, consegna intracoronary è tecnicamente difficile da eseguire, mentre sistemica AAV9 iniezione e iniezione intramiocardica sono più comunemente praticato4,5,7. Anche se iniezione sistemica è facile da eseguire, iniezione intramiocardica convenzionali richiede la toracotomia e la ventilazione meccanica, provoca vasto danno di tessuto e richiede tempo.
In questo rapporto, abbiamo descritto un metodo facile, risparmio di tempo e altamente efficiente per iniezione intramiocardica. L’adenovirus codifica luciferasi e VDR o shRNA VDR, il targeting è stato iniettato per modificare l’espressione genica cardiaco. Una volta imparato, questo metodo può essere utilizzato per la manipolazione del gene, così come l’iniezione di cellule o di altri materiali nel cuore del mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il rapporto attuale dimostra una tecnica modificata per iniezione intramiocardica di vettori virali per la manipolazione del gene cardiaco, che è stato modificato da un metodo per l’induzione di infarto miocardico da Gao et al. 13 attualmente, in vivo caratterizzazione delle funzioni dei geni specifici più spesso coinvolgono la generazione di Ko o topi transgenici3,14,15,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Science Fund per illustri giovani studiosi (81625002), National Natural Science Foundation of China (81470389, 81270282, 81601238), programma di Shanghai Academic Research Leader (18XD1402400), Shanghai Municipal Sostegno di formazione della Commissione Gaofeng medicina clinica Grant (20152209), Shanghai Shenkang Hospital Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 e 14XJ10019), Programma di vela di Shanghai (18YF1413000) e programma di innovazione post-laurea di Bengbu Medical College (Byycx1722). Ringraziamo il dottor Erhe Gao per il suo aiuto precedente nel nostro laboratorio.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
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