Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.
Abstract
Manipulação genética, especificamente no coração significativamente potenciar a investigação de doença cardíaca pathomechanisms e seu potencial terapêutico. Na vivo entrega cardíaco-específicas do gene é comumente conseguida entrega local ou sistêmica. Injeção sistêmica através da veia da cauda é fácil e eficiente em manipular a expressão de gene cardíaco usando vírus adeno-associado recombinante 9 (AAV9). No entanto, esse método requer uma quantidade relativamente alta de vetor para transdução eficiente e pode resultar na transdução de gene nontarget órgão. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e economia de tempo de injeção Intramiocárdica para na vivo manipulação gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia (sem ventilação), os músculos peitorais maiores e menores foram dissecados sem rodeios, e o coração de rato foi rapidamente exposto pelo manual exteriorização através de uma pequena incisão no quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus, codificação do luciferase (Luc) e receptor de vitamina D (VDR) ou RNA de gancho de cabelo curto (shRNA) segmentação VDR, foi injetado com uma seringa Hamilton o miocárdio. Subsequentes na vivo imagem demonstrou que luciferase foi com êxito Blumental especificamente no coração. Além disso, a análise ocidental do borrão confirmou o sucesso superexpressão ou silenciamento de VDR, no coração do mouse. Uma vez dominado, esta técnica pode ser usada para manipulação genética, bem como a injeção de células ou outros materiais, tais como nanogels no coração do mouse.
Introduction
Doença cardíaca é a principal causa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo1,2. A falta de estratégias terapêuticas eficazes para doenças cardíacas fatais e incluindo infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca atrai a exploração intensiva de pathomechanisms subjacentes e identificação de opções terapêuticas novela3. Para estas explorações científicas, manipulação genética cardíaco-específicas é amplamente utilizado4,5. Manipulação genética cardíaca pode ser conseguida editando genoma usando a nuclease efetoras como ativador de transcrição poderoso (TALEN) e agrupados regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) / proteína associada CRISPR 9 (Cas9) ferramentas, ou por entrega de materiais genéticos de gravidez ectópica (por exemplo, vetores de vírus, carregando genes que codificam proteínas de interesse)6. Embora a edição do genoma permite modificações precisas e spatiotemporal genoma em ratos vivos, ainda é uma prática demorada e trabalhosa,6. Alternativamente, manipulação de gene específico cardíaco pelo vírus vetor ou interferindo pequeno entrega complexa de RNA (siRNA) são rotineiramente realizada6.
Entrega de vetor de vírus para o coração de rato adulto é alcançada por aproximadamente duas estratégias: injeção sistêmica ou local. Injeção sistêmica de sorotipo cardiotropic de AAVs como AAV9 é não-invasiva para o gene específico cardíaca manipulação7. No entanto, esse método requer uma quantidade relativamente alta de vetor necessário para transdução eficiente e expressão gênica e pode resultar em significativa transdução do nontarget órgãos tais como o músculo e fígado7. Injeção local de vírus é conseguida por injeção Intramiocárdica ou entrega Intracoronário7. Intracoronário entrega leva a uma distribuição mais uniforme do vírus dentro do coração em comparação com injeção Intramiocárdica. No entanto, as desvantagens desta técnica são a lavagem rápida fora de vetores virais para a circulação sistêmica e transdução em órgãos nontarget8e sua exigência de dispositivos para medição de pressão durante a operação. Por outro lado, permite de injeção Intramiocárdica melhor retenção de vírus no miocárdio, bem como entrega de local específico, mas não consegue distribuir uniformemente viral vector7. Para pequenos animais, entrega Intracoronário é tecnicamente difícil de executar, enquanto sistêmica AAV9 injeção e injeção Intramiocárdica são mais comumente praticada4,5,7. Embora injeção sistêmica é fácil de realizar, injeção Intramiocárdica convencional requer toracotomia e ventilação mecânica, provoca dano tecidual extensa e é demorada.
Neste relatório, nós descrevemos um método fácil, economia de tempo e altamente eficiente para injeção Intramiocárdica. Adenovírus codificação luciferase e VDR ou shRNA alvo VDR, foi injetado para manipular a expressão de gene cardíaca. Uma vez dominado, esse método pode ser usado para manipulação genética, bem como a injeção de células ou outros materiais no coração do mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente relatório demonstra uma técnica modificada para injeção Intramiocárdica de vetores virais para manipulação do gene cardíaca, que foi modificado de um método para indução do infarto do miocárdio por Gao et al 13 atualmente, na vivo caracterização das funções do gene específico geralmente envolvem a geração de nocaute ou ratos transgénicos3,14,15,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo fundo nacional de ciência para ilustres jovens estudiosos (81625002), Nacional Natural Science Foundation da China (81470389, 81270282, 81601238), programa de Shanghai acadêmica líder de pesquisa (18XD1402400), Shanghai Municipal Apoio educação Comissão Gaofeng medicina clínica Grant (20152209), centro de desenvolvimento do Hospital de Shenkang de Shanghai (16CR3034A), Universidade do Tong de Shanghai Jiao (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 e 14XJ10019), Programa de navegação de Shanghai (18YF1413000) e programa de pós-graduação inovação da faculdade de medicina de Bengbu (Byycx1722). Agradecemos sua ajuda anterior Dr. Erhe Gao em nosso laboratório.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
