Простой и эффективный метод для в естественных условиях сердечной специфичные генные манипуляции путем инъекций Intramyocardial мышей
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для сердечной специфичные генные манипуляции в мышах. Под наркозом сердца мыши были экстернализации через четвертое межреберное пространство. Впоследствии аденовирусы, которую кодирования конкретные гены вводили с помощью шприца в миокарде, следуют белка выражение измерения через изображений в естественных условиях и западной помарки анализа.
Abstract
Генные манипуляции непосредственно в самом сердце существенно усиливать расследование Патомеханизмы болезни сердца и их терапевтический потенциал. В естественных условиях сердечной конкретных генов доставки обычно достигается системного или местной доставки. Системные инъекции через хвост Вены легко и эффективно в манипулировании экспрессии генов сердца с помощью рекомбинантной аденоассоциированный вирус 9 (AAV9). Однако этот метод требует относительно большое количество вектора для эффективной передачи и может привести к трансдукции гена nontarget орган. Здесь мы опишем простой, эффективный и экономии времени метод intramyocardial инъекции в естественных условиях сердечной специфичные генные манипуляции в мышах. Под анестезией (без вентиляции) грудные мышцы major и minor тупо были расчленены, и сердце мыши быстро был разоблачен ручной экстернализации через небольшой разрез на четвертый межреберное пространство. Впоследствии аденовирус, кодирование Люцифераза (Люк) и рецептора витамина D (VDR) или шпильки короткие РНК (индуцируемый) ориентации VDR, был введен с помощью шприца Гамильтон в миокард. Последующие в vivo изображений продемонстрировал, что что Люцифераза был успешно гиперэкспрессия непосредственно в самом сердце. Кроме того Западный анализ помаркой подтвердил успешные гиперэкспрессия или глушителей из VDR в самом сердце мыши. Как только освоил, этот метод может использоваться для манипулирования генов, а также инъекции клеток или других материалов, таких как nanogels в самом сердце мыши.
Introduction
Сердечная болезнь является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире1,2. Отсутствие эффективных терапевтических стратегий для жизни болезней сердца, включая инфаркт миокарда и сердечной недостаточности привлекает интенсивное изучение базовых Патомеханизмы и выявление новых терапевтических возможностей3. Для этих научных изысканий сердечной специфичные генные манипуляции является широко используемым4,5. Сердца генные манипуляции и сгруппированы регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) и может быть достигнуто путем изменения генома используя активатор как эффекторных нуклеиназы мощный транскрипции (TALEN) / ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) средства, или Поставка внематочная генетических материалов (например, вирус векторы нося генов, кодирующих белки интерес)6. Хотя изменения генома позволяет точные и пространственно-временных изменений в жизни мышей, он по-прежнему длительным и трудоемким практика6. Кроме того сердечной специфичные генные манипуляции вирус вектор или малые вмешательства РНК (siRNA) комплексная поставка, регулярно выполняется6.
Доставка вектор вируса в сердце взрослого мыши достигается примерно две стратегии: системный или местных инъекций. Системные инъекции кардиотропных серотипа AAVs например AAV9 неинвазивный сердечной определенного гена манипуляций7. Однако этот метод требует относительно высокие количества вектора, необходимых для эффективного трансдукция и экспрессии генов и может привести к значительным трансдукции nontarget органов, таких как мышц и печени7. Местные вирусом инъекций достигается путем инъекций intramyocardial или интракоронарой доставки7. Интракоронарой доставки приводит к более равномерное распределение вируса в сердце, по сравнению с intramyocardial инъекции. Однако недостатки этой техники являются быстрое промывают вирусных векторов для кровообращения и трансдукция nontarget органов8, и его требования устройства для измерения давления во время операции. Напротив intramyocardial инъекции позволяет лучше вирус удержания в миокарде, а также конкретный сайт доставки, но не равномерно распределять вирусных векторов7. Для мелких животных интракоронарой доставка технически трудно выполнить, в то время как системный AAV9 инъекции и intramyocardial инъекции являются более широко практикуется4,5,7. Хотя легко для выполнения системных инъекции, обычных intramyocardial инъекции требует искусственной вентиляции легких и торакотомии, причиняет ущерб растяжение тканей и занимает много времени.
В настоящем докладе мы описали легко, экономия времени и весьма эффективный метод для инъекций intramyocardial. Аденовирусы кодирования Люцифераза и VDR или ориентации VDR, индуцируемый вводили манипулировать экспрессии генов сердца. Как только освоил, этот метод может использоваться для манипулирования генов, а также инъекции клеток или других материалов в самом сердце мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий отчет демонстрирует изменение техника для инъекций intramyocardial вирусных векторов для сердца генные манипуляции, который был модифицирован из метода индукции инфаркт миокарда, Гао и др. 13 в настоящее время, в естественных условиях характеристика конкретных ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национального научного фонда для выдающихся молодых ученых (81625002), национальные естественные науки фонд Китая (81470389, 81270282, 81601238), из Шанхая академических исследований руководитель программы (18XD1402400), Шанхай муниципальных Образования Комиссии Gaofeng клинической медицины Грантовая поддержка (20152209), Шанхай Shenkang больница центр развития (16CR3034A), Шанхайский университет (YG2013MS42), Шанхай Цзяо Тун университета Школа медицины (15ZH1003 и 14XJ10019), Шанхай Парусный программы (18YF1413000) и программа последипломного инноваций в Бэнбу медицинский колледж (Byycx1722). Мы благодарим д-р Erhe Gao за его предыдущих помощь в нашей лаборатории.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
