Une méthode Simple et efficace pour la Manipulation de gène spécifique cardiaque In Vivo par intramyocardique Injection chez la souris
Summary
Nous présentons ici un protocole pour manipulation spécifique cardiaque génétique chez la souris. Sous anesthésie, le coeur de souris ont été externalisé par le quatrième espace intercostal. Par la suite, adénovirus, codage de gènes spécifiques ont été injectés avec une seringue dans le myocarde, suivi par mesure d’expression de protéines via l’imagerie in vivo et Western blot analyse.
Abstract
Manipulation génétique spécifiquement au coeur potentialisent considérablement l’enquête de cardiopathie pathomécanismes et leur potentiel thérapeutique. In vivo la livraison gène spécifique cardiaque est généralement obtenue par livraison locale ou systémique. L’injection systémique via la veine caudale est simple et efficace pour manipuler l’expression des gènes cardiaques à l’aide de virus recombinant adéno-associés 9 (AAV9). Toutefois, cette méthode requiert une quantité relativement élevée de vecteur pour la transduction efficace et peut entraîner dans la transduction du gène orgue non ciblés. Nous décrivons ici une méthode simple, efficace et gagner du temps d’injection intramyocardique pour la manipulation spécifique cardiaque gène in vivo chez la souris. Sous anesthésie (sans ventilation), les muscles pectoraux de majeurs et mineurs ont été disséqués sans ménagement, et le coeur de souris a été rapidement exposé par externalisation manuelle par une petite incision à la quatrième espace intercostal. Par la suite, adénovirus encodage luciférase (Luc) et récepteur de la vitamine D (VDR) ou l’ARN en épingle à cheveux courts (shARN) ciblant les VDR, a été injecté avec une seringue de Hamilton dans le myocarde. Subséquent en vivo imagerie démontré que luciférase a été avec succès surexprimée spécifiquement au cœur. En outre, analyse par Western blot a confirmé la surexpression réussie ou silencieux du VDR dans le coeur de souris. Une fois maîtrisé, cette technique peut servir pour les manipulations génétiques, ainsi que l’injection de cellules ou d’autres matériaux tels que nanogels dans le coeur de souris.
Introduction
La maladie cardiaque est la principale cause de morbidité et mortalité dans le monde1,2. L’absence de stratégies thérapeutiques efficaces pour troubles cardiaques mortelles, y compris l’infarctus du myocarde et insuffisance cardiaque attire une exploration intensive des pathomécanismes sous-jacente et l’identification de nouvelles options thérapeutiques3. Pour ces explorations scientifiques, manipulation génétique spécifique cardiaque est largement utilisé4,5. Manipulation génétique cardiaque peut être réalisée par génome édition utilisant la nucléase effecteur comme activateur de transcription puissant (TALEN) et groupés régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR) / CRISPR associated protein 9 (Cas9) outils, ou par livraison des matériaux génétiques ectopique (p. ex., vecteurs de virus porteurs de gènes codant des protéines d’intérêt)6. Même si génome édition permet les modifications précises et spatio-temporelle du génome chez les souris vivantes, c’est encore une pratique de longues et fastidieuses no6. Alternativement, manipulation de gène spécifique cardiaque par vecteur du virus ou à un petite gêne livraison complexe ARN (siRNA) sont systématiquement effectuée6.
Livraison de vecteur de virus au coeur de souris adulte est réalisée par environ deux stratégies : injection locale ou systémique. L’injection systémique de sérotype cardiotropic de AAVs tels que AAV9 est non invasive pour de manipulation génétique cardiaque7. Toutefois, cette méthode nécessite une quantité relativement élevée de vecteur nécessaire à la transduction efficace et l’expression des gènes et transduction significative des organes ciblés tels que les muscles et le foie7peut entraîner. Injection locale de virus est réalisée par injection intramyocardique ou intracoronaire livraison7. Livraison intracoronaire conduit à une répartition plus égale de virus dans le cœur par rapport à l’injection d’intramyocardique. Toutefois, les inconvénients de cette technique sont le lavage rapid sur des vecteurs viraux pour la circulation systémique et la transduction des organes8, et son exigence de dispositifs de mesure de la pression lors de l’opération. En revanche, permet d’injection intramyocardique meilleure rétention de virus dans le myocarde ainsi que livraison de site spécifique, mais il ne parvient pas à répartir viral vector7. Pour petits animaux, livraison intracoronaire est techniquement difficile à réaliser, alors que l’injection systémique de AAV9 et d’intramyocardique sont plus communément pratiqué4,5,7. Si injection systémique est facile à réaliser, injection conventionnelle intramyocardique exige thoracotomie et ventilation mécanique, provoque des lésions tissulaires vaste et prend du temps.
Dans ce rapport, nous avons décrit une méthode facile, rapide et hautement efficace pour intramyocardique injection. Adénovirus codage luciférase et VDR ou shARN ciblant les VDR, a été injecté pour manipuler l’expression des gènes cardiaques. Une fois maîtrisé, cette méthode peut être utilisée pour les manipulations génétiques, ainsi que l’injection de cellules ou d’autres matériaux dans le coeur de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent rapport illustre une technique modifiée pour injection intramyocardique de vecteurs viraux pour manipulation génétique cardiaque, ce qui a été modifié à partir d’une méthode d’induction de l’infarctus du myocarde par Gao et al. 13 actuellement, en vivo caractérisation des fonctions des gènes spécifiques plus souvent impliquent la génération de masquage ou de souris transgéniques3,14,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Fonds National de la Science d’éminents savants de Young (81625002), Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (81470389, 81270282, 81601238), programme de Shanghai recherche académique Leader (18XD1402400), Shanghai Municipal Le soutien de Grant Education Commission Gaofeng médecine clinique (20152209), Shanghai Shenkang Hospital Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 et 14XJ10019), Programme de voile de Shanghai (18YF1413000) et le programme de troisième cycle de l’Innovation de Bengbu Medical College (Byycx1722). Nous remercions le Dr Erhe Gao pour son aide précédente dans notre laboratoire.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
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