シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法
Summary
ここでマウスの心臓特異的遺伝子操作するためのプロトコルを提案する.麻酔下マウス心が第 4 肋間スペースで外部化。その後、特定遺伝子が生体内イメージングと西洋を介してタンパク質発現の測定によって続いて心筋に注射器で注入したアデノ ウイルス ブロット分析です。
Abstract
中心部に特に遺伝子操作は、心疾患の病因と治療の可能性の検討を大幅増強します。心臓固有遺伝子デリバリー生体内で一般的全身またはローカルの配信を実現します。尾静脈から全身投与が簡単かつ効率的な組換えアデノ随伴ウイルス 9 (AAV9) を使用して心臓の遺伝子発現を操作します。ただし、このメソッドの効率的な伝達ベクトルの比較的高い量を必要とする、非標的臓器の遺伝子導入可能性があります。ここでは、生体内で心臓特異的遺伝子操作マウスの心筋内注入のシンプルで効率的、かつ時間を節約法について述べる。(換気) なし、麻酔下でメジャーとマイナーの胸筋は切除したぶっきらぼうとマウスの心臓だった第 4 肋間スペースに小さな切開を通してマニュアル外部によって公開されるすぐに。その後、エンコード ルシフェラーゼ (リュック) とビタミン D の受容器 (VDR) または短いヘアピン RNA (shRNA) ターゲットに VDR、アデノ ウイルスは、心筋にハミルトン注射器で注入されました。その後体内イメージングを示したそのルシフェラーゼ中心部に特に正常に発現。さらに、西部のしみの分析は成功の過剰発現またはマウスの心臓における VDR の沈黙を確認しました。一度マスター、細胞やマウスの心臓におけるナノゲルなど他の材料の注入と同様、遺伝子操作、このテクニックが使えます。
Introduction
心臓病は、罹患率と死亡率の世界1,2の主要な原因です。心筋梗塞、心不全などの命にかかわる心臓疾患の効果的な治療戦略の欠如は、基になるある集中的な探査と新しい治療オプション3の身分証明書を集めています。これらの科学的な探検の心臓特異的遺伝子操作は広く使われている4,5です。心臓遺伝子操作ゲノム編集強力な転写活性化因子のようなエフェクター ヌクレアーゼ (TALEN) を使用することによって達成することができ、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) をクラスター化 CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9)/ツール、または異所性の遺伝物質 (例えば興味の蛋白質をコードする遺伝子を運ぶウイルスのベクトル) の配信6。生きているマウスに正確と時空間のゲノムの変更が許可されるゲノム編集、それはまだ6時間のかかり、労働集約的な練習。また、ウイルスのベクトルまたは小さな干渉 RNA (siRNA) 複雑な配信が日常的に心臓特異的遺伝子操作は6を実行しました。
成体マウスの心にウイルス ベクター配信は約 2 つの戦略によって達成される: 全身またはローカル注入。Cardiotropic 血清型 AAV9 など通気の全身投与は心筋特異的遺伝子操作7の非侵襲的です。ただし、このメソッドは、効率的な情報伝達と遺伝子発現に必要なベクトルの比較的高い量を必要とする、筋肉や肝臓7非標的臓器の重要な伝達があります。ローカル ウイルス注入は、心筋や冠動脈内配信7によって実現されます。冠動脈内の配信は、心筋内注入と比較して心の中でウイルスのより均等に配分をもたらします。ただし、この手法の欠点は、全身循環し、標的臓器8、および操作中に圧力測定器をその要件の伝達ウイルスのベクトルのうち急速洗浄です。対照的に、ウイルスを均等に失敗した心筋と同様に、サイト固有の配信でもより良いウイルス保持心筋内注入によりベクトル7です。小動物、冠動脈内の配信は技術的に困難、全身性 AAV9 注入と心筋がより一般的に用いられる4,5,7を実行します。全身注入が簡単に実行できますが、従来の心筋内注入機械換気と開胸を必要とする、広範な組織の損傷を引き起こすと時間がかかる。
本報告では、時間を節約、簡単な非常に効率的な心筋内注入法について説明しました。アデノ ウイルス shRNA VDR、ターゲットや VDR、ルシフェラーゼのエンコーディングは、心臓遺伝子発現を操作する注入しました。一度マスター、このメソッドはセルまたはマウスの心臓の他の材料の注入と同様、遺伝子操作の使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のレポートに示します Gaoらによって心筋梗塞誘導法から変更された心臓の発現ウイルスベクターの心筋内注入法が変更されました。13現在、体内特性特定遺伝子の機能のほとんどを含むノックアウト、トランスジェニック マウス3,14,15,16,17…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、著名な若手学者 (81625002)、国家自然科学基金、中国の (81470389、81270282、81601238)、プログラムの上海学術研究リーダー (18XD1402400)、上海市の国立科学基金によって支えられました。教育委員会 Gaofeng 臨床医学助成 (20152209)、上海 Shenkang 病院開発センター (16CR3034A)、上海交通大学 (YG2013MS42)、上海 Jiao はさみ大学大学院医学 (15ZH1003、14XJ10019)上海セーリング プログラム (18YF1413000) と蚌埠市医科大学 (Byycx1722) の大学院イノベーション プログラム。私たちの研究室で彼の以前のヘルプ、博士 Erhe Gao に感謝します
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
