Summary
जीन और विनियामक तत्वों के बीच शारीरिक बातचीत की पहचान चुनौतीपूर्ण है लेकिन गुणसूत्र अनुरूप कब्जा तरीकों से सुविधा दी गई है । इस संशोधन के लिए 4c-seq प्रोटोकॉल पीसीआर टेम्पलेट्स के अधिक से अधिक प्रवर्धन कम से पीसीआर पूर्वाग्रह का शमन और एक अतिरिक्त प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट कदम शामिल करके पढ़ता की मैपर की अधिकतमता.
Abstract
एक दिया लक्ष्य जीन के लिए विनियामक तत्वों की पहचान एक महत्वपूर्ण तकनीकी एक लक्ष्य जीन के लिए नियामक तत्वों की स्थिति और प्रभाव आकार में परिवर्तनशीलता के कारण चुनौती बन गया है । कुछ प्रगति के अस्तित्व के bioinformatic भविष्यवाणी के साथ किया गया है और समीपस्थ epigenetic के साथ जुड़े संशोधनों के समारोह संरक्षित प्रतिलेखन कारक बंधन साइटों का उपयोग कर सक्रिय जीन अभिव्यक्ति. क्रोमेटिन रचना कब्जा अध्ययनों से हमारे अनुक्रम और यहां तक कि एक पूरे जीनोम के भीतर भौतिक क्रोमेटिन संपर्कों को खोजने की क्षमता में क्रांति ला दिया है । परिपत्र क्रोमेटिन अनुरूप कैद अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ युग्मित (4c-seq), विशेष रूप से, इस तरह के एक लक्ष्य जीन या एक विनियामक के रूप में ब्याज (दृष्टिकोण), के एक दिए गए अनुक्रम के लिए सभी संभव भौतिक क्रोमेटिन बातचीत खोजने के लिए बनाया गया है बढ़ाने. वर्तमान 4c-seq रणनीति सीधे दृष्टिकोण के भीतर से अनुक्रम लेकिन कई और विविध दृष्टिकोण की आवश्यकता के लिए एक साथ समान बेस कॉलिंग (इमेजिंग) के तकनीकी चुनौतियों से बचने के अनुक्रम अगली पीढ़ी sequencing प्लेटफार्मों के साथ । प्रयोगों की यह मात्रा कई प्रयोगशालाओं के लिए व्यावहारिक नहीं हो सकती है. यहां, हम 4c-seq प्रोटोकॉल है कि दोनों एक अतिरिक्त प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट और qPCR आधारित प्रवर्धन कदम है कि विविध अनुक्रम के एक अधिक से अधिक कब्जा करने की सुविधा के लिए डिज़ाइन कर रहे है शामिल करने के लिए एक संशोधित दृष्टिकोण की रिपोर्ट पढ़ता है और क्षमता के लिए कम पीसीआर पूर्वाग्रह, क्रमशः । हमारे संशोधित 4c विधि क्रोमेटिन वास्तुकला का आकलन करने के लिए मानक आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला के लिए उत्तरदायी है.
Introduction
जीन अभिव्यक्ति के लिए विनियामक तत्वों की पहचान डीएनए तत्वों (सांकेतिक शब्दों में बदलना) परियोजना है कि मानव जीनोम1,2के ८०% के लिए व्यापक रूप से व्याख्या कार्यात्मक गतिविधि के विश्वकोश द्वारा सुविधा दी गई है । के लिए साइटों की पहचान vivo प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी, DNaseI अतिसंवेदनशीलता, और epigenetic हिस्टोन और डीएनए मिथाइल संशोधन व्यक्तिगत सेल प्रकार में उंमीदवार विनियामक के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए मार्ग प्रशस्त लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के लिए तत्वों । इन निष्कर्षों के साथ सशस्त्र, हम विनियामक तत्वों और जीन के बीच कार्यात्मक संपर्क निर्धारित करने की चुनौती के साथ सामना कर रहे हैं । विशेष रूप से, किसी दिए गए लक्ष्य जीन और उसके बढ़ाने (ओं) के बीच क्या संबंध है? क्रोमेटिन क्षेऽ कैप्चर (3 सी) विधि सीधे इस प्रश्न के पते की पहचान करके शारीरिक, और संभावना कार्यात्मक, ब्याज और उंमीदवार के क्षेत्र के बीच बातचीत तय क्रोमेटिन 3 में छीना घटनाओं के माध्यम से बातचीत अनुक्रम . जैसे-जैसे क्रोमेटिन बातचीत की हमारी समझ बढ़ गई है, तथापि, यह स्पष्ट है कि चयनित उंमीदवार loci की जांच जीन बढ़ाने वाली बातचीत की पूरी समझ प्रदान करने के लिए अपर्याप्त है । उदाहरण के लिए, सांकेतिक शब्दों में बदलना उच्च प्रवाह गुणसूत्र अनुरूप कब्जा कार्बन कॉपी (5C) विधि मानव जीनोम के एक छोटे से हिस्से की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया (1%, ४४ loci के पायलट सेट) और loci के जटिल संपर्क की सूचना दी । जीन और बढ़ाने की पहचान की बातचीत के साथ 2 औसत-4 अलग बातचीत भागीदारों, जिनमें से कई थे kilobases के सैकड़ों दूर रैखिक अंतरिक्ष4में । इसके अलावा, ली एट अल। प्रयुक्त क्रोमेटिन बातचीत विश्लेषण द्वारा युग्मित अंत टैग अनुक्रमण (चिया-पीईटी) पूरे जीनोम प्रमोटर बातचीत का विश्लेषण करने के लिए और पाया कि आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय बाध्यकारी साइटों की ६५% क्रोमेटिन बातचीत में शामिल थे । इन बातचीत के कुछ बड़े, बहु जीन परिसरों जीनोमिक दूरी के kilobases के सैकड़ों फैले और युक्त, औसतन, 8-9 जीन प्रत्येक5में हुई । साथ में, इन निष्कर्षों क्रोमेटिन बातचीत पूछताछ के लिए निष्पक्ष पूरे जीनोम तरीकों की जरूरत पर प्रकाश डाला । इन तरीकों में से कुछ Schmitt एट अलमें समीक्षा कर रहे हैं । 6.
क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा अध्ययन के लिए और अधिक हाल के तरीकों अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ युग्मित (Hi-C और 4c-seq) अज्ञात अनुक्रम के हित6के एक क्षेत्र के साथ बातचीत की खोज को सक्षम करें । विशेष रूप से, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा (4c-seq) पर कब्जा कर लिया क्रोमेटिन समीपस्थ से अनुक्रमण डीएनए द्वारा एक निष्पक्ष तरीके से7 में ब्याज की एक अनुक्रम के साथ बातचीत loci की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था 3 डी अंतरिक्ष में रुचि के क्षेत्र । संक्षेप में, क्रोमेटिन अपने मूल प्रोटीन-डीएनए बातचीत, एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ सट के संरक्षण के लिए तय हो गई है, और बाद में ligated शर्तों को पतला करने के लिए loci बातचीत के "(चित्रा 1) के साथ जैविक रूप से प्रासंगिक" पेचीदा कब्जा । क्रॉस लिंक के लिए प्रोटीन हटाने उलट रहे हैं, इस प्रकार एक दूसरे प्रतिबंध एंजाइम के साथ अतिरिक्त दरार के लिए उपलब्ध डीएनए छोड़ । एक अंतिम बंधाव loci बातचीत के छोटे हलकों उत्पंन करता है । ब्याज के अनुक्रम के लिए प्राइमरों तो परिपत्र विखंडित से अज्ञात दृश्यों की एक परिवर्धित पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, बहाव अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा पीछा किया ।
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत है, जो नमूना तैयारी पर केंद्रित है, दो प्रमुख परिवर्तन करने के लिए मौजूदा 4c-seq तरीकों8,9,10,11,12बनाता है । सबसे पहले, यह एक qPCR आधारित विधि का उपयोग करता है empirically के लिए प्रवर्धन चक्र की इष्टतम संख्या का निर्धारण 4c-seq पुस्तकालय तैयारी कदम है और इस तरह के लिए क्षमता का शमन पीसीआर पूर्वाग्रह पुस्तकालयों के अधिक से अधिक प्रवर्धन से उपजी । दूसरा, यह एक अतिरिक्त प्रतिबंध का उपयोग करता है एक के लिए जाना जाता "चारा" दृश्यों की एकरूपता को कम करने के प्रयास में कदम डाइजेस्ट कि सटीक आधार-बुला अनुक्रमण साधन द्वारा और, इसलिए, प्रत्येक पढ़ा में अद्वितीय, जानकारीपूर्ण अनुक्रम अधिकतम । अंय प्रोटोकॉल कई (12-15)8 विभिंन चारा अनुक्रम और/या प्रतिबंध साइटों, जो अंय प्रयोगशालाओं द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है की एक मात्रा के साथ 4c seq पुस्तकालयों पूलिंग द्वारा इस मुद्दे को दरकिनार । संशोधनों यहां प्रस्तुत प्रयोगों, नमूनों की एक छोटी संख्या की अनुमति है, और/या दोहराने के लिए एक ही गली में अनुक्रमित और परित ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. प्रतिबंध एंजाइम चयन
- ब्याज के एक क्षेत्र की पहचान (जैसे, जीन प्रमोटर, एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNP), बढ़ाने) और जैव प्रौद्योगिकी सूचना (NCBI) के लिए राष्ट्रीय केंद्र के रूप में खजाने से डीएनए अनुक्रम प्राप्त करें ।
- पहले प्रतिबंध एंजाइम पाचन (RE1) के लिए उंमीदवार प्रतिबंध एंजाइमों (REs) की पहचान है कि ब्याज के अनुक्रम के भीतर कटौती नहीं करते हैं, जो चिपचिपा समाप्त होता है (डीएनए टर्मिनी के साथ) पुनः पाचन के बाद, और जिनकी गतिविधियों को बाधित नहीं कर रहे है CpG मिथाइल.
नोट: डेटा का रिज़ॉल्यूशन RE1 द्वारा निर्धारित किया जाता है । एक एंजाइम के साथ एक 6 आधार जोड़ी (बीपी) मान्यता अनुक्रम का उत्पादन, औसत पर, लंबाई में लगभग 4 kilobases (kb) टुकड़े, जबकि एक एंजाइम के साथ एक 4 बीपी पहचान अनुक्रम टुकड़े लगभग २५० बीपी लंबाई में पैदा करता है, और अधिक सटीक अनुमति बातचीत के जुगाड़ की पहचान । - उंमीदवार से एक RE1 का चयन करें १.२ चरण में पहचाने एंजाइमों कि एक "दृष्टिकोण" प्रतिबंध टुकड़ा का उत्पादन कम से ५०० बीपी लंबा है कि ब्याज के क्षेत्र में शामिल है या, वैकल्पिक रूप से, एक पड़ोसी क्षेत्र ।
नोट: चयनित एंजाइम प्राइमर डिजाइन करने के लिए उत्तरदायी होना चाहिए (चरण 2 देखें). - दूसरा पाचन के लिए, एक प्रतिबंध एंजाइम (RE2) एक 4 बीपी पहचान अनुक्रम के साथ की पहचान है कि चिपचिपा समाप्त होता है (डीएनए टर्मिनी के साथ) पुनः पाचन के बाद, जिनकी गतिविधि CpG मिथाइल द्वारा बाधित नहीं है, और प्रतिबंध के भीतर कि कटौती का उत्पादन एक 250-500 बीपी चारा टुकड़ा (चित्रा 1) का उत्पादन करने के लिए RE1 द्वारा उत्पंन टुकड़ा ।
नोट: चयनित एंजाइम प्राइमर डिजाइन करने के लिए उत्तरदायी होना चाहिए (चरण 2 देखें).
2. व्युत्क्रम पीसीआर और पाचन दक्षता qPCR के लिए डिजाइन और टेस्ट प्राइमर
-
ऐसे Primer3 (http://primer3.ut.ee) के रूप में एक प्राइमर डिजाइन उपकरण का प्रयोग करें व्युत्क्रम प्राइमरों कि चारा टुकड़ा के सिरों की ओर बाहर निर्देशित कर रहे है डिजाइन (यानी, 5 ' प्राइमर एक "रिवर्स" प्राइमर, प्लस किनारा करने के लिए पूरक है, जबकि ' 3 प्राइमर एक है " आगे "प्राइमर, ऋण किनारा के पूरक) और के रूप में संभव के रूप में प्रतिबंध साइटों के करीब गैर जानकारीपूर्ण चारा अनुक्रम के प्रवर्धन को कम करने और पीसीआर दक्षता अधिकतम (चित्रा 2a) ।
नोट: प्राइमरों silico पीसीआर भविष्यवाणियों में द्वारा जीनोमिक डीएनए से ंयूनतम गैर विशिष्ट प्रवर्धन है की भविष्यवाणी की जानी चाहिए और अधिक से अधिक 16/18 पहचान9के साथ अपने इच्छित लक्ष्य को छोड़कर जीनोम में कहीं नहीं संरेखित करना चाहिए । sequencing एडाप्टर व्युत्क्रम पीसीआर प्राइमरों में शामिल नहीं कर रहे हैं के रूप में, प्राइमर बंधन की साइट अन्य 4c तैयारी तरीकों की तुलना में अधिक लचीला है; प्राइमरों इसी प्रतिबंध साइट के अंत के ५० बीपी के भीतर बेहतर ऐनी चाहिए ।- प्रवर्धन द्वारा व्युत्क्रम पीसीआर प्राइमरों की विशिष्टता की पुष्टि करें शुद्ध जीनोमिक डीएनए टेंपलेट के रूप में (gDNA) का उपयोग कर ।
- इष्टतम प्राइमरों कुछ उत्पादों उपज जब एक टेंपलेट के रूप में gDNA का उपयोग करना चाहिए (अपेक्षित 4c उत्पादों के वर्णन के लिए ११.२ कदम देखें) । यदि gDNA से काफी प्रवर्धन होता है, नई प्राइमर डिजाइन । कोई स्वीकार्य प्राइमर सेट की पहचान कर रहे हैं, तो चरण 1 पर लौटें और नए प्रतिबंध एंजाइमों का चयन करके एक नया चारा का चयन करें ।
-
डिजाइन qPCR प्राइमरों के टुकड़े बढ़ाना 70-200 न्यूक्लियोटाइड (nt) लंबाई में प्रतिबंध पाचन क्षमता (चित्रा बी) की निगरानी के लिए ।
- डिजाइन प्राइमरों की एक जोड़ी प्रत्येक प्रतिबंध साइट भर में बढ़ाना (चरण 1 में चयनित) कि चारा अनुक्रम को परिभाषित । दोनों RE1 के लिए प्राइमरों डिजाइन (चरण 6.5.6 देखें) और RE2 साइटें (९.२ कदम देखें) ।
- डिजाइन प्राइमरों का एक सेट है कि संवर्धक एक सामांय नियंत्रण (बिना खतना के डीएनए के रूप में या तो प्रतिबंध एंजाइम के लिए साइटों RE1 और RE2 के लिए) (भी कदम 6.5.6 देखें) शामिल नहीं है ।
3. कोशिकाओं का संग्रह
- एक विधि है कि ऊतक या कोशिका संस्कृति के लिए उपयुक्त है का उपयोग करना, एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करें । २०० एक्स जीमें 5 मिनट के लिए कोशिकाओं गोली, supernatant त्यागें और 107 कोशिकाओं के प्रति 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के ५०० µ एल में गोली resuspend ।
4. Formaldehyde पार-कोशिकाओं को जोड़ने क्रोमेटिन बातचीत के संरक्षण के लिए
- 107 कोशिकाओं के प्रति, 1% इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के ९.५ मिलीलीटर-ग्रेड formaldehyde (मेथनॉल) पंजाब और मशीन में जोड़ें, जबकि घुमाव पर tumbling (या इसी तरह), 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर (आरटी, 18-22 डिग्री सेल्सियस) ।
नोट: निर्धारण शर्तों को प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए ऑप्टिमाइज़ करना पड़ सकता है । पहले माउस की कोशिकाओं में प्रकाशित काम की सूचना दी है कि मैप की ंयूनतम ४०% में इष्टतम निर्धारण परिणाम एक औसत आकार गुणसूत्र के लिए एक गैर telomeric क्षेत्र संभालने के दृष्टिकोण9 युक्त गुणसूत्र को संरेखित पढ़ता है । - बर्फ के लिए रिएक्शन ट्यूबों स्थानांतरण और crosslinking प्रतिक्रिया बुझाने के लिए ०.१२५ मीटर (१.४२५ एमएल) के एक अंतिम एकाग्रता के लिए बर्फ ठंडा 1 मीटर glycine जोड़ें । कोमल उलटा द्वारा मिश्रण ।
- २०० x जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और ध्यान से सभी supernatant हटा दें । -८० डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली की दुकान या सेल lysis के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।
5. सेल Lysis
- 5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) धोने के लिए ५०० µ एल में कदम ४.३ से सेल गोली resuspend । २०० आरटी पर 5 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक supernatant त्यागें ।
- ०.५% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) और 1x चिढ़ाने अवरोधकों के साथ 5 मिमी EDTA के १२५ µ एल में सेल गोली resuspend, 5 मिलीग्राम/एमएल antipain, 10 मिलीग्राम/एमएल chymostatin, 10 मिलीग्राम/एमएल leupeptin, और 10 मिलीग्राम/एमएल pepstatin ए युक्त 100x कॉकटेल के रूप में इस तरह के रूप में ।
नोट: डिटर्जेंट एकाग्रता के लिए प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित करना पड़ सकता है । अपर्याप्त डिटर्जेंट सांद्रता अपूर्ण कोशिका lysis में परिणाम होगा, क्रोमेटिन प्रतिबंध एंजाइमों दुर्गम जा । यदि प्रतिबंध पाचन कदम 6.5.6 में लगातार कम है और एंजाइम की गतिविधि की पुष्टि की गई है, अतिरिक्त डिटर्जेंट की आवश्यकता हो सकती है । ०.१% वेतन वृद्धि में एसडीएस एकाग्रता में वृद्धि । - 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन की मशीन ।
नोट: प्राथमिक मानव keratinocytes के लिए, इष्टतम lysis ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक 10 मिनट की मशीन का उपयोग कर प्राप्त किया गया था एक ३७ ° c आंदोलन (९०० rpm) के साथ मिलाते हुए हीटिंग ब्लॉक में रात भर की मशीन के बाद । -
सुनिश्चित करें कि कक्ष lysis पूर्ण है ।
- एक स्लाइड पर Trypan ब्लू के 6 µ एल के साथ कोशिकाओं के 6 µ एल मिश्रण और एक coverslip के साथ कवर । एक खुर्दबीन के नीचे देखें ।
नोट: सफल lysis पर, कोशिकाओं के इंटीरियर नीले और अन-लीजड ड कोशिकाओं सफेद दिखाई देगा प्रकट होना चाहिए । - यदि सेल lysis अपर्याप्त प्रकट होता है, 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं गोली और supernatant बचाने के लिए । गोली resuspend और दोहराएं चरण 5.2-5.4 और/या वैकल्पिक रूप से विभिंन गर्मी तापमान के साथ (५.३ कदम में नोट देखें) ।
- बचाया supernatant के साथ पुनः लीजड ड गोली गठबंधन और आगे बढ़ना ।
नोट: दृश्य निरीक्षण पर्याप्त lysis की गारंटी नहीं है । पाचन क्षमता को निष्पक्ष रूप से चरण 6.5.6 में निर्धारित किया जाना चाहिए ।
- एक स्लाइड पर Trypan ब्लू के 6 µ एल के साथ कोशिकाओं के 6 µ एल मिश्रण और एक coverslip के साथ कवर । एक खुर्दबीन के नीचे देखें ।
6. प्रथम प्रतिबंध पाचन
- जोड़ें 30 μL के 10x प्रतिबंध एंजाइम बफ़र (निर्माता द्वारा निर्दिष्ट) और 27 μL की 20% ट्राइटन X-१०० (अंतिम १.८%) चरण ५.४ से निलंबन के लिए । एच2ओ के साथ ३०० µ एल के लिए कुल मात्रा लाओ ।
नोट: प्रतिबंध एंजाइम बफ़र की संरचना चरण 1 में चुने गए RE पर निर्भर करेगा । - एक "अपच नियंत्रण" के रूप में एक 15 μL aliquot निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
- शेष प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए २०० U RE1 जोड़ें और आंदोलन के साथ एक मिलाते हुए हीटिंग ब्लॉक में एंजाइम के लिए उपयुक्त तापमान पर रात भर गर्मी (९०० rpm) । अगले दिन, एक अतिरिक्त २०० यू RE1 जोड़ें और रात भर गर्मी जारी है ।
- एक "डाइजेस्ट नियंत्रण" के रूप में एक 15 μL aliquot निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
-
पाचन क्षमता का निर्धारण:
- ८२.५ µ l को 10 एमएम Tris-एचसीएल नं० ७.५ के स्टेप्स ६.२ और ६.४ से 15 µ l नमूनों में जोड़ें । proteinase K (20 मिलीग्राम/एमएल) और ६५ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन के २.५ µ एल जोड़ें ।
- phenol-क्लोरोफॉर्म के १०० µ एल जोड़ें और अवशिष्ट प्रोटीन संदूषण को हटाने के लिए उलटा करके जोरदार मिश्रण । 5 मिनट, कमरे के तापमान पर १६,१०० x g के लिए केंद्रापसारक ।
- एक नई ट्यूब के लिए जलीय चरण स्थानांतरण । जोड़ें ६.६६ µ एल के 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच ५.२, 1 µ एल के 20 मिलीग्राम/एमएल ग्लाइकोजन, और ३०० µ एल के १००% इथेनॉल (ेतोः) । 1 एच के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर उलटा और जगह से धीरे मिश्रण ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर १६,१०० x g पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक । supernatant निकालें, ७०% ेतोः के ५०० µ एल जोड़ने के लिए, और 5 मिनट के लिए आरटी पर १६,१०० x जी में केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गोली सूखी । ५० में गोली resuspend µ nuclease के एल मुक्त एच2ओ ।
- qPCR13,14 ∆ ∆ सीटी विधि का उपयोग करके डाइजेस्ट दक्षता का निर्धारण । एक प्रतिबंध साइट पार्श्व नहीं प्राइमर सेट का प्रयोग करें (चरण -8 देखें) सामांय नियंत्रण के रूप में । आगे बढ़ना है अगर पाचन क्षमता > 85% है । अंयथा, कोशिकाओं गोली और दोहराएं कदम 5.2 – 6.5, ६५ ° c चरण ५.३ में पर मशीन का लोप ।
7. प्रथम बंधाव
- हीट-६५ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट की मशीन द्वारा प्रतिबंध एंजाइम को निष्क्रिय । वैकल्पिक रूप से, यदि एंजाइम निष्क्रिय नहीं किया जा सकता है, phenol-क्लोरोफॉर्म निकालने और इथेनॉल का नमूना हाला ।
नोट: उच्च निष्क्रियता तापमान कुछ प्रतिबंध एंजाइमों क्रोमेटिन में प्रोटीन स्वभाव के लिए सिफारिश की है, और यह नकारात्मक नमूना गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं । साथ ही, phenol: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण आदर्श नहीं है, के रूप में यह नमूना के नुकसान में परिणाम है । - एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और nuclease के 6 मिलीलीटर जोड़ें-मुक्त एच2ओ, ७०० µ एल के 10x ligase बफर (६६० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५, ५० मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (MgCl2), 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), 10 मिमी adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी)), और ५० यू टी-4 डीएनए ligase. 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर घूमता और गर्मी से धीरे से मिलाएं ।
- नमूने की एक १०० µ l aliquot को ' ' बंधाव नियंत्रण ' ' के रूप में निकालें ।
-
बंधाव दक्षता निर्धारित करें:
- Proteinase K (20mg/एमएल) के २.५ µ एल जोड़ें और ६५ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच मशीन ।
- phenol-क्लोरोफॉर्म के १०० µ एल जोड़ें और उलटा करके जोरदार मिश्रण । 5 मिनट, RT पर १६,१०० x जी के लिए केंद्रापसारक
- एक नई ट्यूब के लिए जलीय चरण स्थानांतरण । Add ६.६६ µ l के 3 M सोडियम एसीटेट pH ५.२, 1 µ l की ग्लाइकोजन, और ३०० µ l की १००% ेतोः. उलटा और जगह-८० ° c के बारे में 1 एच द्वारा धीरे मिश्रण ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर १६,१०० x g पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक । supernatant निकालें, ७०% ेतोः के ५०० µ l जोड़ें, और 4 ° c पर १६,१०० x g में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और कमरे के तापमान पर गोली सूखी । पानी की 20 µ l में गोली resuspend और एक ०.६% agarose जेल पर लोड "पाचन नियंत्रण" के बगल में ६.५ कदम से ।
नोट: एक अच्छी तरह से ligated नमूना एक अपेक्षाकृत तंग, उच्च आणविक वजन बैंड (चित्रा 3) के रूप में प्रकट करना चाहिए । - यदि बंधाव पर्याप्त है, तो चरण 8 के साथ आगे बढ़ें । अंयथा, ताजा एटीपी (1 मिमी अंतिम एकाग्रता) और नए ligase जोड़ें; 16 ° c पर रातोंरात मशीन और दोहराएं कदम 7.3 – 7.4 ।
8. रिवर्स पार से जोड़ने और अलग क्रोमेटिन
- Proteinase K के 15 µ l जोड़ें (20 मिलीग्राम/एमएल) और पार-लिंक रिवर्स करने के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
- RNase एक (10 मिलीग्राम/एमएल) के 30 µ एल जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट की मशीन ।
- phenol-क्लोरोफॉर्म के 7 मिलीलीटर जोड़ें और उलटा द्वारा जोरदार मिश्रण । 15 मिनट, RT पर ३,३०० x जी केंद्रापसारक
- एक नया ५० एमएल ट्यूब करने के लिए जलीय चरण स्थानांतरण और nuclease के ७.५ मिलीलीटर-नि: शुल्क एच2ओ जोड़ें (ligase बफर में मौजूद डीटीटी पतला करने के लिए, जो अंयथा डीएनए के साथ हाला), 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच ५.६ के 1 मिलीलीटर, 7 µ एल के ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम/ , और १००% ेतोः की ३५ मिलीलीटर । मिश्रण और 1 एच के लिए-८० ° c पर मशीन ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट, ३,९०० x g केंद्रापसारक । supernatant (गोली को देखने के लिए मुश्किल हो सकता है) निकालें, बर्फ के 10 मिलीलीटर ठंड ७०% ेतोः के साथ गोली धो, और 15 मिनट, ३,३०० x 4 डिग्री सेल्सियस पर जी केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और संक्षेप में गोली आरटी पर सूखी 10 मिमी Tris के १५० µ एल में गोली भंग-एचसीएल पीएच ७.५ ३७ डिग्री सेल्सियस पर । -20 ° c पर संग्रहीत या चरण 9 से जारी रखें ।
9. दूसरा प्रतिबंध पाचन: हलकों छंटनी
नोट: बहाव प्रवर्धन चरणों में पीसीआर पूर्वाग्रह के कारण छोटे पर कब्जा कर लिया टुकड़े के प्रतिनिधित्व को कम करने के लिए यह कदम छोटे हलकों बनाता है ।
- नमूना करने के लिए चरण ८.६, जोड़ें ५० µ l के 10x प्रतिबंध एंजाइम बफ़र (निर्माता द्वारा निर्दिष्ट), ३०० µ l की nuclease-मुक्त H2O, और ५० U प्रतिबंध एंजाइम RE2. चुना एंजाइम के लिए उपयुक्त तापमान पर रात भर गर्मी ।
- "पाचन नियंत्रण" के रूप में नमूने के एक 15 µ l aliquot निकालें । चरण ६.५ में वर्णित के रूप में पाचन क्षमता निर्धारित करें ।
10. दूसरा बंधाव और डीएनए शुद्धिकरण
- प्रतिबंध एंजाइम निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में निष्क्रिय । यदि एंजाइम गर्मी निष्क्रिय नहीं किया जा सकता है, एक कॉलम आधारित शोधन किट का उपयोग कर एंजाइम को हटा दें ।
नोट: के रूप में इस परिणाम के नुकसान में नमूना, स्तंभ शुद्धि आदर्श नहीं है । - एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण और १२.१ मिलीलीटर nuclease-free एच2ओ, 10x बंधाव बफर के १.४ मिलीलीटर (६६० mm Tris-एचसीएल, पीएच ७.५; ५० मिमी MgCl2; 10 मिमी डीटीटी; 10 मिमी एटीपी), और १०० यू टी-4 डीएनए ligase । 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
- 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच ५.६, २३३ µ l nuclease-फ्री एच2ओ, 7 µ एल ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम/एमएल), और ३५ मिलीलीटर १००% ेतोः के ४६७ µ एल जोड़ें । मिश्रण अच्छी तरह से और पर गर्मी-८० ° c 1 एच ।
- ४५ मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,९०० x g केंद्रापसारक । supernatant निकालें, ठंड ७०% ेतोः के 10 मिलीलीटर जोड़ें, और 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,३०० x g केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और संक्षेप में कमरे के तापमान पर गोली सूखी । 10 मिमी Tris के १५० µ एल जोड़ें-एचसीएल पीएच ७.५ और गोली को भंग करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, सिलिका कॉलम आधारित पीसीआर शुद्धि किट के साथ नमूनों को शुद्ध करें । कक्षों की आरंभिक संख्या के आधार पर 1 स्तंभ प्रति 3 x 106 कक्षों का उपयोग करें । 10 एमएम Tris-एचसीएल के ५० µ एल के साथ कॉलम Elute, पीएच ७.५ और पूल के नमूने लिए ।
- fluorimetry या spectrophotometry २६० एनएम पर अवशोषक का उपयोग करके एकाग्रता उपाय । 4c टेम्पलेट अब व्युत्क्रम पीसीआर के लिए तैयार है । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या 11 कदम सीधे आगे बढ़ना ।
11. पीसीआर बढ़ाना अज्ञात व्युत्क्रम पीसीआर द्वारा जुगाड़ बातचीत
- प्रवर्धन की रैखिक रेंज का निर्धारण एक पीसीआर १२.५, 25, ५० के खाके कमजोर पड़ने का उपयोग करके, और १०० यदि वांछित, समानांतर में gDNA से बढ़ाना सीधे उत्पादों की तुलना में आदेश गैर विशिष्ट प्रवर्धन की पहचान करने के लिए । 2 मिनट के लिए ९४ ° c पर एक प्रारंभिक विकार का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं भागो; 10 एस के लिए ९४ ° c पर एक विकार कदम से मिलकर 30 चक्र, 1 मिनट के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर एक एनीलिंग कदम है, और 3 मिनट के लिए ६८ ° c पर एक विस्तार कदम; और 5 मिनट के लिए ६८ डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार ।
- एक १.५% agarose जेल पर प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 15 µ एल रैखिक प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए और टेंपलेट गुणवत्ता (चित्रा 4) का आकलन करें । 4c से प्रवर्धन टेम्पलेट कम डीएनए सांद्रता पर असतत बैंडिंग उपज और उच्च सांद्रता पर एक धब्बा चाहिए । धब्बा की उपस्थिति प्रवर्धित 4c ligations की बढ़ी हुई जटिलता को इंगित करता है ।
-
जब गुणवत्ता और व्युत्क्रम पीसीआर उत्पाद की मात्रा से संतुष्ट उत्पंन, एक qPCR स्थापित करने के लिए चक्र के इष्टतम संख्या का निर्धारण करने के लिए प्रवर्धन के लिए उपयोग करें:
- तालिका 2में प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग कर SYBR और ROX रंजक युक्त प्रतिक्रियाओं को सेट करें । जब तक प्रवर्धन ११.२ कदम में उच्च सांद्रता पर रैखिक नहीं है, का उपयोग १०० प्रतिक्रिया प्रति टेम्पलेट के एनजी.
नोट: ROX के अलावा अच्छी तरह से और साइकिल के लिए चक्र के लिए अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट संकेत के सामान्यीकरण की सुविधा. - 2 मिनट के लिए ९४ ° c पर एक प्रारंभिक विकार का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं भागो; ४० 10 एस के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर एक विकार कदम से मिलकर चक्र, 1 मिनट के लिए ५५ ° c पर एक एनीलिंग कदम है, और 3 मिनट के लिए ६८ ° c पर एक विस्तार कदम; और 5 मिनट के लिए ६८ डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार ।
- प्रवर्धन प्लॉट का उपयोग कर प्रतिक्रियाओं का पीक (समापन बिंदु) प्रतिदीप्ति निर्धारित करें । चक्र जो प्रतिक्रियाओं पर पीक प्रतिदीप्ति (चित्रा 5) के 25% तक पहुंचने का निर्धारण ।
नोट: यह उन चक्रों की संख्या है जिनका उपयोग 4c लाइब्रेरीज़ को बढ़ाना करने के लिए किया जाएगा (चरण ११.४ देखें).
- तालिका 2में प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग कर SYBR और ROX रंजक युक्त प्रतिक्रियाओं को सेट करें । जब तक प्रवर्धन ११.२ कदम में उच्च सांद्रता पर रैखिक नहीं है, का उपयोग १०० प्रतिक्रिया प्रति टेम्पलेट के एनजी.
- तालिका 3 में के रूप में व्युत्क्रम पीसीआर सेट अप करने के लिए अज्ञात अनुक्रम 4c टेंपलेट से चारा को ligated बढ़ाना । चलाने से पहले ५० µ एल की 16 प्रतिक्रियाओं में विभाजित । 2 मिनट और एक विकार कदम के लिए ९४ ° c पर 10 एस, 1 मिनट के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर एक एनीलिंग कदम के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकार का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं चलाने के लिए, और ६८ ° c पर एक विस्तार कदम के लिए 3 min. step 11.3.3 में निर्धारित चक्रों की संख्या का उपयोग करें ।
- लीजिए और प्रतिक्रियाओं पूल । एक सिलिका कॉलम आधारित पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर शुद्ध । प्रति 16 प्रतिक्रियाओं में कम से कम 2 स्तंभों का उपयोग करें । शुद्ध पीसीआर उत्पादों पूल ।
- नमूना मात्रा और शुद्धता spectrophotometry द्वारा निर्धारित करें । ठेठ पैदावार A260/A280 ~ १.८५ के साथ 10 और 20 μg के बीच कर रहे हैं । यदि अवशोषण अनुपात उप-इष्टतम, पुन: शुद्ध क्रम में अनुक्रमण के दौरान समस्याओं को रोकने के लिए कर रहे हैं ।
- एक १.५% agarose जेल पर शुद्ध पीसीआर उत्पाद के ३०० एनजी को अलग करके पुस्तकालय की जटिलता का आकलन करें ।
नोट: प्रवर्धित उत्पाद चरण ११.२ से समान होना चाहिए ।
12. तृतीय प्रतिबंध पाचन: बंद चारा दृश्यों ट्रिम
नोट: इस कदम के नीचे अनुक्रमण चरणों में जानकारीपूर्ण कब्जा कर लिया दृश्यों को अधिकतम करने के लिए व्युत्क्रम पीसीआर उत्पादों से गैर जानकारीपूर्ण चारा अनुक्रम निकालता है । डाइजेस्ट क्षमता की निगरानी करने के लिए, एक "डाइजेस्ट मॉनिटर"15 समकक्ष डीएनए और एंजाइम एकाग्रता का उपयोग समानांतर में पचता है. यदि RE1 और RE2 एक साथ पाचन के लिए असंगत हैं, उदाहरण के लिए, अलग इष्टतम मशीन तापमान या प्रतिक्रिया बफ़र्स के कारण, यह एक अनुक्रमिक डाइजेस्ट के रूप में किया जाना चाहिए (यह आदर्श नहीं है) ।
- एक पुनः डाइजेस्ट मॉनिटर प्राप्त करने और एक ५० µ एल प्रतिक्रिया में पाचन परीक्षण ।
नोट: यह dsDNA के एक अणु है (उदाहरण के लिए, एक प्लाज्मिड, पीसीआर amplicon, या सिंथेटिक डीएनए) जिसमें पुनः साइट (ओं) । केवल आवश्यकता है कि यह एक agarose जेल पर बिना खतना के मॉनिटर से काट भेद करने के लिए आसान होना चाहिए । अनुकूलन पुनः जन और एंजाइम एकाग्रता की निगरानी अगर जरूरत है । - डाइजेस्ट 1 चरण ११.६ से शुद्ध व्युत्क्रम पीसीआर उत्पाद के µ जी और, समानांतर में, चरण १२.१ से पुन: मॉनिटर ।
नोट: डीएनए और एंजाइम एकाग्रता, साथ ही मशीन समय, परीक्षण के लिए के रूप में एक ही होना चाहिए के लिए चरण १२.१ में डाइजेस्ट व्युत्क्रम पीसीआर उत्पाद और मॉनिटर पचा के लिए । आवश्यकतानुसार प्रतिक्रिया मात्रा समायोजित करें । - चलाने के लिए उपयुक्त एकाग्रता की एक agarose जेल पर पचता पुनः मॉनिटर अपेक्षित टुकड़े के लिए । जब डीएनए का < 10% बिना खतना के रहता है तो पाचन पर्याप्त माना जाता है (चित्रा 6) ।
- एक सिलिका कॉलम आधारित डीएनए शुद्धि किट पर पचता व्युत्क्रम पीसीआर उत्पाद शुद्ध । यदि अनुक्रमिक डाइजेस्ट की आवश्यकता है, दोहराएं कदम 12.1-12.4 दूसरा एंजाइम के साथ ।
13. अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी
-
एडाप्टर संबंधित अगली पीढ़ी sequencing मंच के साथ संगत Ligate ।
- एडाप्टर प्रत्येक RE1 और RE2 के लिए डिज़ाइन करें ताकि, ओलिगोस्पर्मिया एनीलिंग के बाद, प्रत्येक पुनः एडेप्टर संबंधित 1-तरफा बदस्तूर है ।
नोट: HindIII उपयोग किया जाता है, तो उदाहरण के लिए, annealed एडेप्टर एक 5 ' phosphorylated "AGCT" बदस्तूर शामिल होना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, मानक T-बदस्तूर एडाप्टर का उपयोग किया जाता है, तो अंत-मरंमत और एक-पूंछ लायब्रेरी से पहले एडेप्टर बंधाव । - एनएन ने संबंधित अनुकूलक री ओलिगोस्पर्मिया । एनीलिंग बफर में ओलिगोस्पर्मिया (10 मिमी Tris, पीएच ७.५, ५० मिमी सोडियम क्लोराइड (NaCl), 1 मिमी EDTA) resuspend, ५० equimolar मीटर करने के लिए µ मात्रा में मिश्रण, ९५ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी, और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए धीमी गति से शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- बंधाव प्रतिक्रिया निष्पादित करें । annealed एडेप्टर की कुल 5-से 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त (चरण 13.1.2; 50:50 अनुपात प्रत्येक पुनः एडेप्टर उपयोग के लिए) 1x ligase बफर में और 6U डीएनए ligase जोड़ने के साथ फिर से पचा 4c पुस्तकालय मिश्रण । निर्माता के निर्देशों के अनुसार मशीन ।
- एक कम-रेफरेंस वॉल्यूम सिलिका-आधारित स्तंभ किट का उपयोग कर शुद्ध करके अतिरिक्त एडेप्टर निकालें ।
- एडाप्टर प्रत्येक RE1 और RE2 के लिए डिज़ाइन करें ताकि, ओलिगोस्पर्मिया एनीलिंग के बाद, प्रत्येक पुनः एडेप्टर संबंधित 1-तरफा बदस्तूर है ।
-
आकार-चयन करें ।
नोट: आकार चयन भी एक मनका आधारित क्लीनअप किट का उपयोग किया जा सकता है और कॉलम शुद्धि के बाद भी सिफारिश की है ।- एक 2% agarose जेल डाली एक उच्च संकल्प agarose का उपयोग कर, एक गैर यूवी डालने से पहले दाग जोड़ने । सुनिश्चित करें कि किसी भी पानी हीटिंग के दौरान वाष्पीकरण के कारण खो बोतल या कुप्पी वजन से पहले और हीटिंग के बाद और पानी जोड़ने के लिए खो मास की वसूली की जगह है ।
- जेल पर एडाप्टर ligated पुस्तकालयों भागो, नमूनों के बीच खाली लेन जा रहा है ।
- एक्साइज जेल स्लाइस करने के लिए इसी आकार सीमा १५० bp 1 kb करने के लिए एक स्वच्छ स्केलपेल या उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर ।
- एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर जेल से पुस्तकालयों को शुद्ध । डीएनए की वसूली में GC पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर जेल स्लाइसें भंग.
- qPCR द्वारा पीसीआर प्रवर्धन के लिए चक्र की संख्या का निर्धारण 4 तालिकामें प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग कर । 2 मिनट और ४० चक्र के लिए ९८ डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकार का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं भागो 10 एस के लिए ९८ ° c पर एक विकार कदम से मिलकर, 1 मिनट के लिए ६० ° c पर एक एनीलिंग कदम है, और 3 मिनट के लिए ७२ ° c पर एक विस्तार कदम ।
नोट: चक्र जिस पर प्रतिदीप्ति अधिकतम के 25% तक पहुंचता है चक्र है कि पुस्तकालय बढ़ाना, के रूप में ११.३ कदम में इस्तेमाल किया जाएगा की संख्या है । - 5 तालिकामें प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग कर पुस्तकालयों बढ़ाना । 2 मिनट और एक विकार कदम के लिए ९८ डिग्री सेल्सियस पर 10 एस, एक एनीलिंग चरण के लिए ६० ° c पर 1 मिनट के लिए, और 3 मिनट के लिए ७२ ° c पर एक विस्तार कदम से मिलकर चक्र के लिए ९८ ° c पर एक प्रारंभिक विकार का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं चलाएं । प्रत्येक लाइब्रेरी के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रवर्धन चक्रों की संख्या चरण १३.३ में निर्धारित की गई थी.
- एक कम रेफरेंस वॉल्यूम सिलिका-आधारित कॉलम किट का उपयोग कर प्रवर्धित पुस्तकालयों को शुद्ध करना ।
14. sequencing और अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण
- एक fluorimetric परख का उपयोग कर प्रवर्धित पुस्तकालयों की सांद्रता निर्धारित करें । अनुक्रमण के लिए उपयुक्त एकाग्रता के लिए पुस्तकालयों को पतला (sequencing सेवा या उनकी सिफारिश के लिए कोर के साथ की जाँच करें).
- एक microfluidic न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण मंच का उपयोग कर पुस्तकालयों की गुणवत्ता का निर्धारण ।
नोट: लायब्रेरी का आकार प्रोफ़ाइल चरण १३.२ में आकार चयन जेल पर देखा है कि दर्पण होना चाहिए, और इस चरण में निर्धारित नमूना की एकाग्रता sequencing के लिए उपयोग किया जा करने के लिए है । - पूल अनुक्रमित पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए ंयूनतम ३,०००,००० पढ़ता है (कम से ५० bp पढ़ें; एकल [1X50] या युग्मित अंत [2X50]) प्रति नमूना । किसी उच्च-गुणवत्ता लायब्रेरी की आवश्यकता है कम से १,०००,००० मैप किया गया9पढ़ता है, लेकिन मैपिंग के दौरान कुछ उदासीनता होगा । उदाहरण के लिए, एक अनुक्रमण मंच है कि पैदावार लगभग १५०,०००,००० पढ़ता प्रति लेन में एक ही लेन में ५० नमूनों को समायोजित कर सकते हैं ।
15. अनुक्रम डेटा का विश्लेषण
- मल्टीप्लेक्स अनुक्रमणिका अनुक्रम का उपयोग करके डेटा उनके उपयुक्त नमूनों को पढ़ता असाइन करने के लिए ।
नोट: अपने परिचित पर निर्भर करता है, उपयोगकर्ताओं को कच्चे फसता/FASTQ अनुक्रम फ़ाइलें बुनियादी कमांड लाइन इंटरफेस का उपयोग या, वैकल्पिक रूप से, उपयोगकर्ता के अनुकूल, वेब आधारित आकाशगंगा ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI)16 के बहाव अभिकलनी विश्लेषण प्रदर्शन कर सकते है . - ट्रिम एडाप्टर अनुक्रम और किसी भी चारा अनुक्रम 12 चरण में अपूर्ण पुनः पाचन से उत्पंन होने वाले, उदाहरण के लिए, फास्ट एक्स Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) का उपयोग कर ।
- नक्शा division reads for ब्याज के उपयुक्त जीनोम (जैसे, UCSC mm10, hg19) का उपयोग कर बिल-व्हीलर संरेखण (BWA)17 या अंय संरेखण सॉफ्टवेयर सैम आउटपुट फ़ाइलों में जिसके परिणामस्वरूप । यदि आवश्यक हो, samtools18 के माध्यम से BAM के लिए सैम फ़ाइलों को परिवर्तित (१५.४ कदम देखें) ।
- डेटा का विश्लेषण करने और इंटरैक्शन को पहचानने के लिए 4c-seq विश्लेषण पाइपलाइन जैसे Basic4Cseq19, 4c-केर20, FourCSeq21या fourSig22 का उपयोग करें.
नोट: डेटा विश्लेषण और तत्संबंधी गुणवत्ता का आकलन चयनित सॉफ्टवेयर पैकेज के संदर्भ मैनुअल के अनुसार आयोजित किया जाना चाहिए । संकुल जहां उल्लेख के अलावा बिस्तर उत्पादन फ़ाइलों को उत्पंन । संक्षेप में, Basic4CSeq19 एक इनपुट सैम फ़ाइल (चरण १५.३) के लिए बातचीत (txt, झगड़ा, बिस्तर कल्पना का उपयोग करता है, और विग आउटपुट फ़ाइलें) और वान डी Werken एट अलमें उल्लिखित मानदंडों के आधार पर डेटा की गुणवत्ता का आकलन है । 9 4c-केर20 (इनपुट छंटनी FASTQ, चरण १५.२) और FourCSeq21 (इनपुट BAM, चरण १५.३) शर्तों के बीच अंतर बातचीत की पहचान । fourSig22 (इनपुट सैम) भी महत्वपूर्ण बातचीत की पहचान करता है और उन है कि reproducible होने की संभावना है प्राथमिकता । एनोटेशन उपकरण (ग्रेट)23, या सांकेतिक शब्दों में बदलना डेटा सेट के साथ एकीकरण के जीनोमिक विनियामक संवर्धन जैसे उपकरण भी 4c-seq द्वारा की खोज की बातचीत के जैविक समारोह भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्राथमिक मानव keratinocytes से अलग थे 2-3 छोड़ दिया नवजात चमड़ी, परित, और KSFM में संस्कृत 30 µ जी के साथ पूरक/एमएल गोजातीय पिट्यूटरी निकालने, ०.२६ एनजी/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक, और ०.०९ mM कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2 ) ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड । कोशिकाओं को दो कुप्पी में विभाजित किया गया था, और एक कुप्पी CaCl2 के अलावा द्वारा विभेदित किया गया था १.२ मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए ७२ h. 107 कोशिकाओं proliferating और विभेदित keratinocyte आबादी से प्रत्येक 1% में तय किया गया कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए formaldehyde । अलग से, K562 कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक RPMI में उगाया गया । 107 कोशिकाओं के कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1% formaldehyde में तय किया गया ।
कोशिकाएँ लीजड ड थीं, और तय क्रोमेटिन को HindIII और ligated के साथ ऊपर बताए अनुसार पचता था. परस्पर लिंक उलट थे, और डीएनए शुद्ध और CviQI के साथ पचा रहा है । डीएनए ligated और व्युत्क्रम पीसीआर प्रवर्धन के लिए टेंपलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था । प्राइमरों में इस्तेमाल किया गया: 5 '-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/CCTCCCTTCACATCTTAGAATG । 1 शुद्ध व्युत्क्रम पीसीआर उत्पाद के µ जी CviQI के साथ समानांतर में २२५ पुनः डाइजेस्ट की निगरानी और कॉलम के एनजी-शुद्ध पचा गया था । शुद्ध डीएनए तो HindIII के साथ समानांतर में १२५ पुनः डाइजेस्ट की निगरानी और कॉलम-शुद्धि के एनजी के साथ रातोंरात पचा गया था । २५० शुद्ध डबल पचा व्युत्क्रम पीसीआर उत्पाद के एनजी पुस्तकालय तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया था । संक्षेप में, समाप्त होता है 5 '-phosphorylated और कुंद-समाप्त होता है और बाद में डीएनए कॉलम-शुद्धि के लिए रूपांतरण के माध्यम से मरंमत की गई । समाप्त होता है एक-७२ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट में एक ५० µ एल प्रतिक्रिया के साथ 1 U Taq पोलीमरेज़ और २०० µ मीटर dATP और कॉलम-शुद्ध थे । संगत अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी एडाप्टर एक 10:1 में ligated थे (अनुकूलक: डीएनए) 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक 30 µ एल प्रतिक्रिया में टी-4 डीएनए ligase का उपयोग कर अनुपात और डीएनए कॉलम-शुद्धि । पुस्तकालयों 2% agarose जेल पर चला रहे थे, जेल स्लाइसें १२० बीपी से एडाप्टर को दूर करने के लिए सीढ़ी के ऊपर से काट रहे थे, और पुस्तकालयों शुद्ध थे । २०० प्रत्येक पुस्तकालय के स्नातकोत्तर 10 µ एल qPCR प्रतिक्रियाओं में मूल्यांकन प्राइमरों युक्त इष्टतम पीसीआर प्रवर्धन चक्र निर्धारित करने के लिए मूल्यांकित किया गया । पुस्तकालयों को qPCR द्वारा निर्धारित चक्र की संख्या का उपयोग कर सूचकांक जोड़ने के लिए परिलक्षित किया गया और एक HiSeq2500 पर अनुक्रम 1x50 प्राप्त करने के लिए पढ़ता है ।
यहां पर पुस्तकें मल्टीप्लेक्स और छंटनी की गई । पहले, sequencing एडेप्टर निकाल दिए गए थे । तत्पश्चात प्रत्येक प्राइमरी की शुरुआत से लेकर प्रतिबंध स्थल तक परिक्रमा कर छंटनी की गई । यह व्युत्क्रम पीसीआर उत्पादों की मैपिंग को सक्षम करता है जो लाइब्रेरी तैयारी से पहले पूरी तरह से पच नहीं रहे थे । महत्वपूर्ण बात यह है कि प्राइमरी बाइंडिंग साइट और प्रतिबंध साइट के बीच अनुक्रम सहित गैर विशेष रूप से परिवर्धित पीसीआर उत्पाद की मैपिंग को रोकता है । ट्रिम किया गया पढ़ता BWA का उपयोग hg38 के लिए मैप किए गए थे । चित्रा 7 से पता चलता है दृष्टिकोण आसपास के क्षेत्र में मानचित्रण पढ़ता है ।
चित्र 1:4c-seq कार्यप्रवाह की योजनाबद्ध । क्रोमेटिन पार से जुड़ा हुआ है प्रोटीन का संरक्षण-डीएनए संपर्क, RE1 के साथ पचा, और ligated loci बातचीत लिंक । परस्पर लिंक उलट रहे हैं, और डीएनए RE2 और ligated के साथ पचा रहा है । अज्ञात बातचीत अनुक्रम प्राइमरों है कि ब्याज के क्षेत्र में बांध का उपयोग कर परिलक्षित कर रहे हैं, और पीसीआर उत्पादों RE1 और RE2 के साथ पचा रहे है ज्ञात दृश्यों ट्रिम कर दीजिए । अज्ञात अनुक्रम की परिवर्धित डीएनए एक अनुक्रमण पुस्तकालय प्रस्तुत करने में प्रयोग किया जाता है, जिसमें एडेप्टर ligated हैं और पुस्तकालय पीसीआर-प्रवर्धित और अनुक्रम है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: प्राइमर डिजाइन के योजनाबद्ध । (क) व्युत्क्रम पीसीआर प्राइमरों के लिए बाध्यकारी साइटों । प्राइमरों "जावक" (यानीउंमुख कर रहे हैं, ' 5 प्राइमर एक "रिवर्स" प्राइमर, प्लस किनारा के पूरक है, जबकि 3 ' प्राइमर एक "आगे" प्राइमर, ऋण किनारा के पूरक है) और ५० प्रत्येक प्रतिबंध स्थल के बीपी के भीतर बांध (लाल द्वारा संकेत छायांकन) । (ख) प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट दक्षता निर्धारित करने के लिए qPCR प्राइमरों के लिए बाध्यकारी साइटों । एक प्राइमरी जोड़ी प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम साइट पार्श्व । एक नियंत्रण प्राइमर सेट एक अनुक्रम है कि या तो एंजाइम के लिए एक साइट शामिल नहीं करता है और डीएनए इनपुट के लिए सीटी मूल्यों को सामान्य करने के लिए प्रयोग किया जाता है प्रवर्धित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: Agarose जेल RE1-पच क्रोमेटिन के लिए बंधाव दक्षता का आकलन करने के लिए ट्रो. बिना खतना के, HindIII-पच, और ligated नमूने proteinase कश्मीर के साथ इलाज किया गया और पार से रिवर्स करने के लिए गरम-लिंक, phenol: क्लोरोफॉर्म निकाले गए, ेतोः उपजी, और एच2में resuspend O. शुद्ध डीएनए एक ०.६% agarose जेल और द्वारा visualized बैंड पर चला गया था ethidium ब्रोमाइड 1 केबी प्लस सीढ़ी की तुलना के साथ धुंधला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
आरेख 4:4c पीसीआर के लिए अनुमापन टेंपलेट । धारावाहिक कमजोर पड़ने की वजह से बनाया गया था 4c टेंपलेट्स और व्युत्क्रम पीसीआर प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया । पीसीआर उत्पादों १.५% agarose जेल पर चला रहे थे और 1 केबी प्लस सीढ़ी के साथ ethidium ब्रोमाइड धुंधला द्वारा visualized । एनटीसी नहीं-टेंपलेट नियंत्रण प्रतिक्रिया का अर्थ है । नोट एकाग्रता में वृद्धि के साथ प्रवर्धन में एक correlative वृद्धि हुई है । इस प्रतिनिधि प्रवर्धन क्रोमेटिन पर आयोजित किया गया था RE1 और CviQI के रूप में RE2 के रूप में HindIII से सट, और प्राइमरी के लिए इस्तेमाल किया अनुक्रम व्युत्क्रम पीसीआर प्रवर्धन 5 ' थे-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: qPCR प्रवर्धन की मध्यस्थता का निर्धारण चक्र का प्रतिलोम पीसीआर के लिए टेम्पलेट बढ़ाना आवश्यक है. 4c टेम्पलेट्स एक वास्तविक समय thermocycler में 1x SYBR ग्रीन और 1x ROX युक्त प्रतिक्रियाओं में परिलक्षित किया गया. पीक प्रतिदीप्ति निर्धारित किया गया था और पीक प्रतिदीप्ति के ¼ तक पहुंचने के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या की गणना की गई थी । चक्र की इस संख्या के व्युत्क्रम पीसीआर के लिए 4c टेंपलेट बढ़ाना इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: Agarose जेल ट्रो के पचा पुनः मॉनिटर पर्याप्त पाचन का संकेत है । पुनः डाइजेस्ट मॉनिटर मानव जीनोमिक डीएनए से प्रवर्धित प्राइमरों का उपयोग कर रहा था एफ: 5 '-TCCTATCCCTGGTCTGTCTTAT और आर: 5 '-CCACATTGGTCCTTCTAGTCTTC और शुद्ध । २२५ मॉनिटर के एनजी 15 यू CviQI के साथ एक ५० µ एल प्रतिक्रिया में 25 डिग्री सेल्सियस रात भर में पचा लिया और 1 केबी प्लस सीढ़ी के साथ एक १.५% agarose जेल पर चला गया था । बैंड ethidium ब्रोमाइड धुंधला के साथ visualized थे । काटा हुआ मॉनिटर है २५१५ bp; अपेक्षित अंश आकार १३२, ३४३, ४८८, ५३९, और १०१३ bp हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: दृष्टिकोण क्षेत्र के 5 kb के भीतर पढ़ें कवरेज के प्रतिनिधि जीनोमिक ट्रैक । पढ़ता छंटनी और BWA का उपयोग कर hg38 के लिए मैप किए गए थे । के बहुमत के पढ़ता है (नीली चोटियों) HindIII या CviQI साइटों से सटे HindIII साइटों पर संरेखित करें, के रूप में की उंमीद है । नजरिया क्षेत्र लाल रंग में डाला जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| 1x के लिए वॉल्यूम | |
| 10x लंबा टेंपलेट 1 बफर विस्तार | २.५ µ l |
| dNTPs (10 मिमी) | ०.५ µ l |
| फॉरवर्ड प्राइमर | ३५ pmol |
| रिवर्स प्राइमर | ३५ pmol |
| विस्तृत करेंलंबा टेंपलेट पोलीमरेज़ (5 U/µ l) | ०.३५ µ l |
| डीएनए | |
| Nuclease-मुफ्त पानी | को 25 µ l |
तालिका 1:-4c टेंपलेट (चरण ११.१) के प्रवर्धन के लिए पीसीआर रिएक्शन मिश्रण ।
| 1x के लिए वॉल्यूम | |
| 10x लंबा टेंपलेट 1 बफर विस्तार | १.५ µ l |
| dNTPs (10 मिमी) | ०.३ µ l |
| फॉरवर्ड प्राइमर | 21 pmol |
| रिवर्स प्राइमर | 21 pmol |
| 100x SYBR हरी I | ०.१५ µ l |
| 50x ROX | ०.३ µ l |
| विस्तृत करेंलंबा टेंपलेट पोलीमरेज़ (5 U/µ l) | ०.२१ µ l |
| डीएनए | १०० एनजी |
| Nuclease-मुफ्त पानी | को 25 µ l |
तालिका 2: प्रतिलोम पीसीआर (Step 11.3.1) के लिए प्रवर्धन चक्र की संख्या के निर्धारण के लिए qPCR रिएक्शन मिक्सचर ।
| 1x के लिए वॉल्यूम | |
| 10x लंबा टेंपलेट 1 बफर विस्तार | ८० µ l |
| dNTPs (10 मिमी) | 16 µ l |
| फॉरवर्ड प्राइमर | १.१२ nmol |
| रिवर्स प्राइमर | १.१२ nmol |
| विस्तृत करेंलंबा टेंपलेट पोलीमरेज़ (5 U/µ l) | ११.२ µ l |
| डीएनए | ३.२ µ छ |
| Nuclease-मुफ्त पानी | को ८०० µ l |
तालिका 3. पीसीआर का रिएक्शन मिक्सचर का अंतिम प्रतिलोम पीसीआर प्रवर्धन के लिए 4c टेम्पलेट (चरण ११.४).
| 1x के लिए वॉल्यूम | |
| 5x Phusion HF बफर | 2 µ l |
| dNTPs (10 मिमी) | ०.२ µ l |
| Miltiplexing प्राइमरी १.० | 5 pmol |
| Miltiplexing प्राइमरी २.० | ०.१ pmol |
| इंडेक्स प्राइमर | 5 pmol |
| 100x SYBR हरी I | ०.१ µ l |
| 50x ROX | ०.२ µ l |
| Phusion पोलीमरेज़ | ०.१ µ l |
| डीएनए | 2 µ l |
| Nuclease-मुफ्त पानी | से 10 µ l |
तालिका 4: अनुक्रमण पुस्तकालय प्रस्तुत करने के लिए प्रवर्धन चक्र की संख्या के निर्धारण के लिए qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण (चरण १३.३) ।
| 1x के लिए वॉल्यूम | |
| 5x Phusion HF बफर | 10 µ l |
| dNTPs (10 मिमी) | 1 µ l |
| Miltiplexing प्राइमरी १.० | 25 pmol |
| Miltiplexing प्राइमरी २.० | ०.५ pmol |
| इंडेक्स प्राइमर | 25 pmol |
| Phusion पोलीमरेज़ | ०.५ µ l |
| डीएनए | 10 µ l |
| Nuclease-मुफ्त पानी | को ५० µ l |
तालिका 5: अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों के प्रवर्धन के लिए पीसीआर रिएक्शन मिश्रण (चरण १३.४) ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4c परिणाम क्रोमेटिन बातचीत है कि पहले से अज्ञात नियामक तत्वों और/या लक्ष्य जीन है कि एक विशिष्ट जैविक संदर्भ में महत्वपूर्ण है की पहचान कर सकते है प्रकट करने की क्षमता है24,25,26। हालांकि, तकनीकी बाधाएं इन प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों को सीमित कर सकती हैं । -4c प्रोटोकॉल में टेम्पलेट के अधिक प्रवर्धन से पीसीआर पूर्वाग्रह की संभावना है । इस प्रोटोकॉल एक उद्देश्य तरीके से प्रवर्धन चक्र की इष्टतम संख्या निर्धारित करने के लिए qPCR का उपयोग करके इस मुद्दे को संबोधित करते हैं । इसके अलावा, प्रतिबंध डाइजेस्ट द्वारा प्रवर्धित व्युत्क्रम पीसीआर उत्पादों से चारा अनुक्रम को हटाने के दो कारणों के लिए क्रोमेटिन बातचीत की पहचान की सुविधा कर सकते हैं । सबसे पहले, यह गैर की लंबाई-जानकारीपूर्ण (चारा) सामग्री से आधार जोड़े को अनुक्रम हो कम कर देता है । दूसरा, और एक परिणाम के रूप में, यह संभावना है कि अधिक पढ़ता विविध दृश्यों से उत्पन्न हो जाएगा बढ़ जाती है (एक संपत्ति सटीक आधार कॉलिंग के लिए आवश्यक) और इस प्रकार अधिक जानकारीपूर्ण बातचीत अनुक्रम मैप किया जा सकता है. अन्य प्रोटोकॉल अलग चारा दृश्यों और/या प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर कई पुस्तकालयों के पूलिंग की आवश्यकता होती है या सटीक आधार कॉलिंग के लिए अनुक्रम एकरूपता मुद्दे को दरकिनार करने के लिए अनुक्रम नमूना के phiX एकाग्रता बढ़ाने की आवश्यकता है । इस विधि अतिरिक्त phiX के साथ मूल्यवान अनुक्रमण क्षमता पर कब्जा किए बिना एक ही sequencing लेन में जमा किया जा करने के लिए एक ही चारा अनुक्रम के साथ कई नमूनों की अनुमति देता है.
सेल निर्धारण और lysis महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम हैं, दोनों जिनमें से विशेष सेल प्रकार के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । अपर्याप्त निर्धारण के लिए ब्याज की एक क्षेत्र और उसके बातचीत दृश्यों के बीच विशिष्ट संपर्कों को बनाए रखने में विफल हो जाएगा, जानकारीपूर्ण शोर से हावी डेटा उपज । इसके विपरीत, अधिक निर्धारण प्रतिबंध एंजाइमों क्रोमेटिन सट करने की क्षमता में कमी, कम जानकारीपूर्ण बंधाव घटनाओं में जिसके परिणामस्वरूप होगा । दोनों निर्धारण एकाग्रता और मशीन समय इस चर का अनुकूलन करने के लिए बदला जा सकता है । इसी तरह, अपर्याप्त कोशिका lysis प्रतिबंध एंजाइमों क्रोमेटिन के उपयोग को कम कर देता है, फिर जानकारीपूर्ण बंधाव घटनाओं की संख्या को कम करने । हमारे हाथ में, मानव प्राथमिक keratinocytes लीजड ड सबसे प्रभावी ढंग से hypotonic शर्तों और डिटर्जेंट का एक संयोजन का उपयोग कर । अंय कक्ष प्रकारों में भिंन lysis शर्तों की आवश्यकता हो सकती है, जिंहें empirically निर्धारित करना होगा । कुशल lysis ऐसे Trypan नीले दाग के रूप में सूक्ष्म डाई अपवर्जन तरीकों से पहचाना जा सकता है ।
4c विधि की एक सीमा है कि परिणाम केवल जनसंख्या औसत का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । एक विषम कोशिका आबादी के साथ, यह सच बातचीत बनाम जैविक परिवर्तनशीलता के कारण शोर का निर्धारण करने के लिए मुश्किल हो सकता है । जबकि एक सेल लाइन या कोशिकाओं की छंटाई के लिए एक सजातीय कोशिका जनसंख्या के उपयोग के लिए स्पष्ट संकेत उत्पंन की भविष्यवाणी की है, व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच परिवर्तनशीलता अभी भी शोर का एक संभव स्रोत है । एकल-कक्ष अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में हाल के अग्रिमों इस समस्या को दूर करने की क्षमता है । इसके अतिरिक्त, जनसंख्या-आधारित 4c परिणामों की मांयता ऐसी डिजिटल छोटी बूंद पीसीआर या मछली के रूप में इन परिणामों को एकल-कक्ष स्तर पर प्रतिबिंबित होते है यह निर्धारित करने के लिए तरीकों का उपयोग किया जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
इस काम को NIAMS (R01AR065523) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2 M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1 M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
References
- Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N.
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
- Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
- Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
- Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
- Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
- Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
- Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
- Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
- McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
- Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
- Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
- Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).
