حمض الهيالورونيك أساس الهلاميات المائية للثقافة 3-الأبعاد من الخلايا جليوبلاستوما المستمدة من المريض
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لثقافة جليوبلاستوما المستمدة من المريض الخلايا ضمن الحيوية أورثوجونالي الانضباطي مصممة لتقليد الدماغ مصفوفة ثلاثية الأبعاد. ويوفر هذا النهج في المختبر، المنهاج التجريبي الذي يحافظ على العديد من الخصائص في فيفو جليوبلاستوما الخلايا فقدت عادة في الثقافة.
Abstract
جليوبلاستوما (GBM) هو سرطان الجهاز العصبي المركزي الأكثر شيوعاً، ومع ذلك الأكثر فتكاً. في السنوات الأخيرة، ركزت العديد من الدراسات على كيف المصفوفة خارج الخلية (ECM) البيئة الدماغ فريدة من نوعها، مثل حمض الهيالورونيك (ها)، يسهل تطور الخليج للحاسبات الآلية والغزو. ومع ذلك، تتضمن معظم نماذج الثقافة في المختبر خلايا الخليج للحاسبات الآلية خارج إطار إدارة المحتوى في المؤسسة. تكثيفها مورين GBM الخلايا تستخدم عادة كذلك. بيد أن النماذج في فيفو تجعل من الصعب على عزل مساهمات السمات الفردية لمعقدة وورم المكروية لسلوك الورم. هنا، يمكننا وصف منصة ثقافة المستندة إلى المائية، وثلاثي الأبعاد (3D) ها أن يسمح للباحثين بشكل مستقل تغيير تركيز هكتار وصلابة. ارتفاع الوزن الجزيئي هكتار والبولي إيثيلين غليكول (شماعة) تتألف الهلاميات المائية، التي كروسلينكيد عن طريق إضافة مايكل من نوع حضور الخلايا الحية. الثقافات 3D المائية المستمدة من المريض GBM الخلايا معرض السلامة وانتشار معدلات جيدة أو أفضل منها، عند مثقف جليوماسفيريس القياسية. كما يتيح نظام المائية إدماج الببتيدات ECM mimetic لعزل آثار التفاعلات ECM الخلية المحددة. الهلاميات المائية تكون شفافة بصريا بحيث يمكن تصويرها خلايا حية في ثقافة 3D. وأخيراً، ها المائية الثقافات متوافقة مع التقنيات القياسية للتحليلات الجزيئية والخلوية، بما في ذلك بكر، النشاف الغربية وكريوسيكتيونينج متبوعاً تلطيخ الفلورة.
Introduction
نظم الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد الخص التفاعلات بين الخلايا وهذه المصفوفة خارج الخلية المحيطة بها (ECM) في الأنسجة الأصلية أفضل من على نظرائهم ثنائي الأبعاد (2D)1،2. التقدم في مجال هندسة الأنسجة قد أسفرت عن منصات ثقافة متطورة، 3D التي تمكن التحقيقات التي تسيطر عليها في المكونات المادية والكيميائية 1) كيف مصفوفة المكروية تؤثر على سلوك الخلية و 2) فعالية جديدة العلاجية استراتيجيات لعدد من الأمراض، بما في ذلك السرطان2. بينما نماذج في المختبر لا مراعاة للعوامل النظامية، مثل إشارات المناعي، والغدد الصماء، وهكذا لا يمكن أن تحل تماما في فيفو نماذج، أنها توفر العديد من المزايا بما في ذلك إمكانية تكرار نتائج، التحكم التجريبية، القدرة على تحمل التكاليف والسرعة. هنا، يمكننا وصف استخدام المخ mimetic الهلاميات المائية في 3D التي التقاط ثقافات خلايا ورم الدماغ المستمدة من المريض العديد من جوانب فسيولوجية الورم، على وجه الخصوص، القوى المحركة للحصول على معاملة المقاومة3. مقارنة بالأساليب الأخرى في المختبر ، هذه الثقافات تمثل أفضل النماذج في فيفو الورم والملاحظات السريرية3.
جليوبلاستوما (GBM) هو السرطان الأكثر تواترا والفتاكة التي تنشأ في الدماغ، مع متوسط بقاء فقط 1-2 سنوات4،5. في السنوات الأخيرة، ركزت العديد من الدراسات على تأثير البيئة مصفوفة ورم في GBM6،،من78. تم الإبلاغ عن ECM الدماغ فريدة تؤثر الهجرة الخلية الخليج للحاسبات الآلية والانتشار والمقاومة العلاجية6،،من78،9،10،11 , 12-حمض الهيالورونيك (ها) هو glycosaminoglycan وفيرة (هفوة) في الدماغ، حيث يتفاعل مع غيره الكمامات ومش بروتيوجليكانس لتشكيل المائية مثل13. وأفادت الدراسات العديد من أوفيريكسبريشن هكتار في الخليج للحاسبات الآلية الأورام وآثاره اللاحقة على السرطان التقدم8،9،13،،من1415،16 ،17. مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة الأخرى تؤثر أيضا على الخليج للحاسبات الآلية الورم النمو وغزو6،7،،من1518. على سبيل المثال، حمل هيتيروديميريزيشن مستقبلات إنتغرين سطح الخلية من خلال الربط بالتسلسل “إدارات” فيبرونيكتين وفيترونيكتين، والتي هي عادة overexpressed في الخليج للحاسبات الآلية، والشروع في الشلالات الإشارات المعقدة التي تعزز بقاء الورم19 ،،من2021. بالإضافة إلى التأثيرات البيوكيميائية، تؤثر الخصائص الفيزيائية للمصفوفة الأنسجة أيضا GBM التقدم22،23.
اكتساب مقاومة للعلاج المستمر أحد الدوافع الرئيسية للخليج للحاسبات الآلية الفتك4. المخدرات يظهر نتائج واعدة في 2D أو جليوماسفيري نماذج فشلت في الدراسات الحيوانية اللاحقة والحالات السريرية3، مشيراً إلى أن آثار العوامل ميكرونفيرونمينتال ساهم مساهمة كبيرة في الخليج للحاسبات الآلية الورم استجابة1. بينما يمكن أن توفر نماذج حيوانية 3D، الناحية الفسيولوجية المناسبة المكروية للخلايا المريض إكسينوجرافتيد وتوليد النتائج ذات الصلة سريرياً24،25، تعقد الدماغ المكروية في فيفو يجعل من التحدي لتحديد الميزات، بما في ذلك التفاعلات الخلية-مصفوفة، النتائج البيولوجية الرئيسية المحددة. تحديد الأهداف العلاجية الجديدة ستستفيد من استخدام منصات الثقافة المبسطة التي يتم تعريف الخصائص الفيزيائية والكيميائية الحيوية.
وخلافا لنماذج مادة بيولوجية تم الإبلاغ عنها سابقا من الخليج للحاسبات الآلية ورم المكروية26،27 التي لم تحقق صحيح التحكم الفردية ملامح البيوكيميائية والفيزيائية إدارة المحتوى في المؤسسة، منهاج مادة بيولوجية متعامد تمكن هنا ذكرت فصل مساهمات متعددة الميزات المستقلة إلى الخليج للحاسبات الآلية خلية النمط الظاهري. نقدم هنا، نظام المائية المستندة إلى ها، أورثوجونالي الانضباطي، للثقافة 3D من الخلايا GBM المستمدة من المريض. الهلاميات المائية تتشكل من مكونين البوليمر: ها 1) النشطة وخامل 2) بيولوجيا البولي إثيلين غليكول (الربط). الوتد مادة متوافق حيويا وماء مستخدمة على نطاق واسع مع البروتين منخفض الامتزاز والحد الأدنى الاستمناع28. هنا، هي فونكتيوناليزيد حوالي 5% مويتيس حمض الغلوكورونيك على سلاسل هكتار مع جماعات ثيول لتمكين crosslinking إلى متاحة تجارياً 4-ذراع-شماعة إنهاء مع ماليميديس عن طريق إضافة مايكل من نوع. في شكله الأكثر شيوعاً في الجسم، توجد هكتار في سلاسل عالية الوزن الجزيئي (حمو). هنا، ودرجة منخفضة من التعديل “حمو هكتار” (500-750 كاتشين) يساعد على الحفاظ على التفاعلات أصلي هكتار ولها مستقبلات الخلية، بما في ذلك CD4429. عن طريق استبدال ثيول شماعة لهكتار-ثيول مع المحافظة على نسبة مولى ثابتة من إجمالي ثيولس إلى ماليميديس، يمكن انفصلت تركيز هكتار من الخواص الميكانيكية الهلاميات المائية الناتجة عن ذلك. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام ضوابط المقايسة متزاوجة الببتيدات منتهية سيستين لعدد متوسط محددة من الأسلحة تم إنهاء ماليميدي في كل 4-الذراع-شماعة. دمج الببتيدات المشتقة من إدارة المحتوى في المؤسسة، ولاصقة يمكن من التفاعلات مع إينتيجرينس في الخلايا المستزرعة، من خلالها الإشارات الكيميائية الحيوية والكيميائية هي ترانسدوسيد1. إضافة ماليميدي-ثيول يحدث بسرعة كبيرة تحت الظروف الفسيولوجية، تقليل الوقت المطلوب لتغليف الخلايا وبقاء الخلايا المستمدة من المريض إلى أقصى حد. وعلاوة على ذلك، الثقافات المائية يمكن أن يعامل مثل عينة نموذجية من الأنسجة ومتوافقة مع تقنيات توصيف القياسية بما في ذلك النشاف الغربية والتدفق الخلوي وتلطيخ الفلورة. البروتوكول التالي يصف الإجراءات لاختلاق الهلاميات المائية، إنشاء ثقافات 3D المستمدة من المريض الخلايا الخليج للحاسبات الآلية والتقنيات لتحليل الكيمياء الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب توليد بيانات استنساخه باستخدام هذا النظام ثلاثي الأبعاد الثقافة: 1) تتفق ثيوليشن دفعة لدفعة من ها، 2) الممارسة لتحقيق كفاءة خلط السلائف المائية والتعامل مع hydrogel الثقافات لمنع الضرر و 3) الأمثل البذر كثافة لكل خط الخلية المستخدمة.
عند نسبة وزن خاص من ها المطلوب هو في الما…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R21NS093199)، وجائزة 3R “قوس جامعة كاليفورنيا”. نتوجه بالشكر الخالص إلى المختبر للدكتور هارلي كورنبلوم لتوفير خطوط الخلية HK301 و HK157. كما نشكر جامعة كاليفورنيا الأنسجة المختبرية الأساسية علم الأمراض (تبكل) على كريوسيكتيونينج، مرفق الأساسية المتقدمة الخفيفة الميكروسكوب/التحليل الطيفي (الزكاة) في معهد نانوسيستيمس كاليفورنيا (الهوية) في جامعة كاليفورنيا لاستخدام المجهر [كنفوكل]، معهد جامعة كاليفورنيا دمدم التصوير الجزيئي لاستخدام نظام التصوير إيفيس، جامعة كاليفورنيا الجزيئية الأجهزة مركز (MIC) لتوفير التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي، والتدفق الخلوي الأساسية في جونسون شاملة سرطان مركز (جككك) في جامعة كاليفورنيا لتوفير التهوية لتدفق الخلوي.
Materials
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. . Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. 암 연구학. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 – 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
- Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
- Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
- Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
- Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. Role of hyaluronan in glioma invasion. Cell adhesion & migration. 2 (3), 202-207 (2008).
- Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
- Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
- Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
- Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
- Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
- Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
- Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
- Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
- Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
- Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
- Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
- Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
- Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
- Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman’s reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
- Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).
