Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para cultura tridimensional de células de glioblastoma paciente-derivado dentro ortogonalmente sintonizáveis biomateriais projetados para imitar a matriz do cérebro. Essa abordagem fornece uma em vitro, plataforma experimental que mantém muitas características de na vivo glioblastoma células tipicamente perdidas na cultura.
Abstract
Glioblastoma (GBM) é o câncer mais comum, ainda mais letal, do sistema nervoso central. Nos últimos anos, muitos estudos têm focado como a matriz extracelular (ECM) do ambiente exclusivo do cérebro, como o ácido hialurónico (HA), facilita a invasão e a progressão do GBM. No entanto, a maioria em vitro cultura de modelos incluem células GBM fora do contexto de um ECM. Xenografts murino de células GBM são usados geralmente também. No entanto, na vivo modelos dificultam a isolar as contribuições das características individuais do microambiente do tumor complexo comportamento do tumor. Aqui, descrevemos uma plataforma de base de hidrogel, tridimensional (3D) cultura HA que permite que os pesquisadores independentemente alterar a rigidez e a concentração de HA. Alto peso molecular HA e polietileno glicol (PEG) compõem o hidrogel, que são a quitosana através da adição de Michael-tipo na presença de células vivas. Culturas de hidrogel 3D do paciente-derivado viabilidade de exposição de células GBM e proliferação taxas tão bom quanto, ou melhor, quando cultivadas como padrão gliomaspheres. O sistema de hidrogel também permite a incorporação de peptídeos ECM-mimética para isolar os efeitos de interações específicas célula-ECM. Hidrogel é opticamente transparente para que células vivas podem ser fotografadas na cultura 3D. Finalmente, HA hidrogel culturas são compatíveis com as técnicas convencionais para análises moleculares e celulares, incluindo PCR, mancha ocidental e cryosectioning seguido por mancha da imunofluorescência.
Introduction
Sistemas tridimensionais (3D) cultura recapitulate interações entre células e a sua envolvente da matriz extracelular (ECM) em tecidos nativos melhores que seus bidimensional (2D) homólogos1,2. Avanços na engenharia de tecidos têm rendido plataformas sofisticada cultura 3D que permitem investigações controladas em componentes 1) como químicas e físicas da matriz microambiente afetam célula comportamentos e 2) a eficácia de novas terapêuticas estratégias para uma série de doenças, incluindo câncer2. Enquanto modelos em vitro não podem considerar fatores sistêmicos, tais como sinais do sistema endócrino e imunes e, portanto, não podem substituir completamente modelos na vivo , eles fornecem várias vantagens, incluindo a reprodutibilidade, controle experimental, acessibilidade e velocidade. Aqui, descrevemos o uso do cérebro-mimética hidrogel em 3D que culturas de células de tumor de cérebro de paciente-derivado capturar muitos aspectos da fisiologia de tumor, em particular, a dinâmica de aquisição de resistência do tratamento3. Em comparação com outros métodos em vitro , essas culturas melhor representam modelos de tumor na vivo e observações clínicas3.
Glioblastoma (GBM) é o câncer mais frequente e letal, originários do cérebro, com uma sobrevida média de apenas 1-2 anos,4,5. Nos últimos anos, muitos estudos têm incidido sobre a influência do ambiente de matriz de tumor em GBM6,7,8. O único cérebro ECM tem sido relatado para afetar resistência terapêutica6,7,8,9,10,11 , proliferação e migração de células GBM , 12. ácido hialurônico (Ah) é um glicosaminoglicano abundante (GAG) no cérebro, onde ele interage com outros GAGs e proteoglicanos para formar um hidrogel, como malha13. Muitos estudos têm relatado a superexpressão de HA em tumores GBM e seus efeitos subsequentes sobre câncer progressão8,9,13,14,15,16 ,17. Outros componentes de ECM também afetam GBM tumor crescimento e invasão6,7,15,18. Por exemplo, fibronectina e vitronectina, que normalmente são overexpressed em GBM, induzem a heterodimerization de receptores de superfície integrinas celular através da ligação à sequência de “RGD” e iniciar o complexas cascatas de sinalização que promovem a sobrevivência de tumor19 ,20,21. Além de influências bioquímicas, propriedades físicas da matriz de tecido também afetam GBM progressão22,23.
Aquisição contínua de resistência às terapias é um dos principais motores do GBM letalidade4. Mostrando resultados promissores em modelos 2D ou gliomasphere de drogas falharam em estudos subsequentes em animais e casos clínicos3, indicando que os efeitos dos fatores microenvironmental contribuíram significativamente para GBM tumor resposta1. Enquanto modelos animais podem fornecer um 3D, fisiologicamente adequadas microambiente para xenografted células doentes e gerar resultados clinicamente relevantes24,25, a complexidade do cérebro microambiente na vivo torna-se desafiador para determinar quais recursos, incluindo interações célula-matriz, são os resultados-chave para específica biológicos. Identificação de novos alvos terapêuticos beneficiará da utilização de plataformas de cultura simplificado de propriedades bioquímicas e biofísicas definidas.
Ao contrário dos modelos anteriormente relatados biomaterial do GBM tumor microambiente26,27 que não alcançaram o verdadeiro controle ortogonal sobre características físicas e bioquímicas individuais de ECM, a plataforma de biomateriais relatados aqui permite desacoplamento das contribuições dos vários recursos independentes de fenótipo de células GBM. Aqui, apresentamos um sistema de hidrogel HA-based, ortogonalmente ajustáveis, para cultura 3D do paciente-derivado de células de GBM. Hidrogel é formados a partir de dois componentes de polímero: HA 1) biologicamente ativo e 2) biologicamente inerte polietileno glicol (PEG). PEG é um material biocompatível e hidrofílico amplamente utilizado com adsorção de baixa proteína e imunogenicidade mínimo28. Aqui, cerca de 5% de partes de ácido glicurônico HA correntes são acrescida com grupos tiol para habilitar ligando para um comercialmente disponível 4-braço-PEG finalizado com maleimides através da adição de Michael-tipo. Na sua forma mais comum no corpo, HA existe em cadeias de alto peso molecular (HMW). Aqui, um baixo grau de modificação de HMW HA (500-750 kDa) ajuda a preservar interações nativas de HA e seus receptores celulares, incluindo CD4429. Substituindo PEG-tiol para HA-tiol, mantendo uma constante relação molar de tióis totais de maleimides, HA concentração pode ser dissociada da propriedades mecânicas de hidrogel a resultante. Além disso, controles estequiométricos podem ser usados para conjugar terminada em cisteína peptídeos para um número definido de médio de braços maleimide terminada em cada 4-braço-PEG. Incorporação de peptídeos derivados de ECM, adesivos permite interações com integrinas em culturas de células, através do qual os sinais bioquímicos e químicos são transduzidas1. Adição de maleimide-tiol ocorre muito rapidamente em condições fisiológicas, minimizando o tempo necessário para encapsulamento de célula e maximizando a sobrevivência de células derivadas de paciente. Além disso, culturas de hidrogel podem ser tratadas como amostra de tecido típico e são compatíveis com as técnicas de caracterização padrão incluindo mancha ocidental, citometria de fluxo e mancha da imunofluorescência. O protocolo seguinte descreve os procedimentos para a fabricação de hidrogel, estabelecer 3D culturas de células GBM derivado de paciente e técnicas de análise bioquímica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geração de dados podem ser reproduzidos usando este sistema de cultura 3D requer: 1) consistente para lotes thiolation de HA, 2) prática para atingir eficiente mistura de precursores de hidrogel e manipulação de hidrogel culturas para evitar danos e 3) otimizado de semeadura densidade para cada linha de celular usada.
Quando uma porcentagem de peso específico de HA é desejada no hidrogel, o grau de thiolation de HA determina a densidade de ligação cruzada. Recomendamos usar uma quanti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado com recursos do NIH (R21NS093199) e prêmio do UCLA ARC 3R. Nossos sinceros agradecimentos vão para o laboratório do Dr. Harley Kornblum para fornecimento das linhas celulares HK301 e HK157. Agradecemos também núcleo de patologia laboratório de UCLA tecido (TPCL) para cryosectioning, instalação de núcleo de microscopia de luz avançado/espectroscopia (ALMS) em Califórnia nanosistemas Institute (CNSI) na UCLA para uso do microscópio confocal, UCLA Crump Instituto para Imagem molecular para o uso de sistema de imagem IVIS, UCLA Molecular instrumentação Center (MIC) para fornecer a espectroscopia de ressonância magnética e fluxo Cytometry núcleo em Jonsson abrangente Cancer Center (JCCC) na UCLA para fornecimento de instrumentação para o fluxo de citometria.
Materials
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
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