Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für dreidimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen innerhalb orthogonal abstimmbaren Biomaterialien entwickelt, um das Gehirn-Matrix zu imitieren. Dieser Ansatz bietet eine in Vitro, experimentelle Plattform, die viele Eigenschaften von in Vivo Glioblastom-Zellen in der Regel in Kultur verloren beibehält.
Abstract
Glioblastom (GBM) ist die häufigste, aber tödlichsten, Zentralnervensystem Krebs. In den letzten Jahren haben viele Studien fokussiert wie die extrazelluläre Matrix (ECM) der einzigartigen Gehirn Umwelt, wie Hyaluronsäure (HA), GBM fortschreiten und Invasion erleichtert. Jedoch enthalten die meisten in-vitro- Kultur Modelle GBM-Zellen außerhalb des Kontexts von ECM. Murine Xenotransplantate von GBM-Zellen werden häufig auch verwendet. In Vivo Modellen erschweren jedoch die Beiträge der einzelnen Merkmale des komplexen Tumor Mikroumgebung Tumor Verhalten zu isolieren. Hier beschreiben wir eine HA Hydrogel-basierte, dreidimensionale (3D) Kultur-Plattform, die Forscher zu HA-Konzentration und Steifigkeit unabhängig voneinander verändern können. Hohes Molekulargewicht HA und Polyethylenglykol (PEG) umfassen Hydrogele, die vernetzt über Michael-Type-Zusatz im Beisein von lebenden Zellen sind. 3D Hydrogel Kulturen des Patienten abgeleitet GBM Zellen Ausstellung Lebensfähigkeit und Verbreitung Preise so gut wie oder besser als, wenn kultiviert als standard Gliomaspheres. Die Hydrogel-System ermöglicht auch eine Einbindung von ECM-mimetischen Peptiden, Auswirkungen von bestimmten Zelle-ECM-Interaktionen zu isolieren. Hydrogele sind optisch transparent, so dass lebende Zellen in 3D Culture abgebildet werden können. Zu guter Letzt sind HA Hydrogel Kulturen kompatibel mit Standardtechniken für Molekulare und zelluläre Analysen, einschließlich PCR, Western blotting und Kryoschneiden gefolgt von Immunfluoreszenz-Färbung.
Introduction
Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme rekapitulieren Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) in nativen Gewebe besser als ihre zweidimensionale (2D) Pendants1,2. Fortschritte in der Gewebetechnik haben anspruchsvolle, 3D Kultur-Plattformen, die kontrollierte Untersuchungen (1) wie chemische und physikalische Komponenten der Matrix Mikroumgebung beeinflussen Zelle Verhaltensweisen und (2) die Wirksamkeit der neue ermöglichen ergab therapeutische Strategien für eine Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs2. Während in-vitro- Modelle können nicht systemische Faktoren, wie z. B. Hormon- und Immunsystem Signale entfallen und können somit in Vivo Modellen nicht vollständig ersetzen, bieten sie einige Vorteile einschließlich der Reproduzierbarkeit, experimentelle Kontrolle, Erschwinglichkeit und Geschwindigkeit. Hier beschreiben wir die Verwendung von Gehirn-mimetischen Hydrogele in welchen, die 3D Kulturen des Patienten abgeleitet Gehirn Tumorzellen viele Aspekte der Tumor Physiologie, insbesondere die Dynamik des Erwerbs von Behandlung Resistance3erfassen. Im Vergleich zu anderen in-vitro- Methoden, repräsentieren diese Kulturen besser in Vivo Tumormodellen und klinischen Beobachtungen3.
Glioblastom (GBM) ist der häufigste und tödlichen Krebs mit Ursprung im Gehirn, mit eine mediane Überlebenszeit von nur 1-2 Jahre-4,–5. In den letzten Jahren haben viele Studien über den Einfluss der Tumor Matrix Umwelt im GBM6,7,8konzentriert. Das einmalige Gehirn ECM wurde berichtet, dass GBM Zellwanderung, Verbreitung und therapeutischen Widerstand6,7,8,9,10,11 beeinflussen , 12. Hyaluronsäure (HA) ist ein reichlich Glykosaminoglykan (GAG) im Gehirn, wo es interagiert mit anderen GAGs und Proteoglykane eine Hydrogel-wie zu bilden mesh-13. Viele Studien haben berichtet, HA-Überexpression in GBM Tumoren und seine Folgewirkungen auf Krebs Fortschreiten8,9,13,14,15,16 ,17. Anderen ECM-Komponenten wirken sich auch GBM Tumor Wachstum und Invasion6,7,15,18. Z. B. Fibronektin und Vitronectin, die in der Regel bei Glioblastom überexprimiert sind, Heterodimerization der Zell-Oberfläche Integrin-Rezeptoren durch Bindung an die “RGD” Sequenz zu induzieren und initiieren komplexe signaltechnische Kaskaden, die Förderung der Tumor überleben19 ,20,21. Neben biochemischen Einflüssen physikalische Eigenschaften der Gewebe Matrix wirken sich auch GBM Fortschreiten22,23.
Kontinuierliche Übernahme des Widerstands zu Therapien ist einer der Haupttreiber der GBM Letalität4. Medikamente mit vielversprechenden Ergebnissen in 2D- oder Gliomasphere Modelle haben versagt, in nachfolgenden tierexperimentellen Studien und klinische Fälle3, darauf hinweist, dass die Auswirkungen von microenvironmental Faktoren wesentlich zur GBM Tumor Antwort1beigetragen. Während Tiermodelle eine 3D bereitstellen können, physiologisch angemessen Sie Mikroumgebung, xenografted patientenzellen und generieren klinisch relevante Ergebnisse24,25, die Komplexität des Gehirns Mikroumgebung in Vivo zu macht es schwierig um zu bestimmen, welche Features, einschließlich der Zelle-Matrix Interaktionen, Schlüssel zu bestimmten biologischen Ergebnisse sind. Identifizierung von neuen therapeutischen Ziele profitieren von der Verwendung von vereinfachten Kultur Plattformen in der biochemische und biophysikalische Eigenschaften definiert sind.
Im Gegensatz zu bereits gemeldeten Biomaterial-Modellen der GBM Tumor Mikroumgebung26,27 die wahre orthogonal Kontrolle über individuellen biochemischen und physikalischen Eigenschaften der ECM, die Biomaterial-Plattform noch nicht erreicht haben berichtet hier ermöglicht die Entkopplung der Beiträge von mehreren unabhängigen Funktionen, GBM Zelle Phänotyp. Hier präsentieren wir Ihnen ein HA-basierten, Orthogonal abstimmbaren Hydrogel-System für 3D Culture von GBM-Zellen Patienten abgeleitet. Hydrogele sind aus zwei Polymerkomponenten gebildet: 1) biologisch aktive HA und 2) biologisch inert Polyethylenglykol (PEG). PEG ist ein weit verbreitetes biokompatibel und hydrophilen Material mit niedrigem Eiweißgehalt Adsorption und minimalen Immunogenität28. Hier sind etwa 5 % der glucuron-Säure Moieties auf HA-Ketten mit Thiol-Gruppen ermöglichen Vernetzung zu einer handelsüblichen 4-Arm-Koppelung mit Maleimides über Michael-Type-Zusatz beendet funktionalisiert. In seiner häufigsten Form im Körper existiert HA in hohem Molekulargewicht (HMW) Ketten. Hier hilft ein geringer Grad der Modifizierung der HMW HA (500-750 kDa), um native Interaktionen von HA und die Zell-Rezeptoren, einschließlich CD4429zu bewahren. Mit der Substitution von PEG-Thiol für HA-Thiol unter Beibehaltung einer Konstanten Molverhältnis von insgesamt Thiole, Maleimides, kann HA-Konzentration von mechanischen Eigenschaften des resultierenden Hydrogele entkoppelt werden. Darüber hinaus können stöchiometrischen Steuerelemente zu Cystein-terminierte Peptide auf eine definierte durchschnittliche Maleimide-terminierte Arme auf jeder 4-Arm-PEG-Konjugat verwendet werden. Einbeziehung der ECM-abgeleitet, selbstklebende Peptide kann Interaktionen mit Integrine auf kultivierten Zellen, durch die biochemische und chemische Signale ausgestrahlt1sind. Maleimide-Thiol-Zusatz erfolgt sehr schnell unter physiologischen Bedingungen, minimieren den Zeitaufwand für Zelle Kapselung und Maximierung Überleben der Patienten gewonnenen Zellen. Darüber hinaus Hydrogel Kulturen wie typische Gewebeprobe behandelt werden können und sind kompatibel mit standard Charakterisierung Techniken einschließlich Western blotting, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz-Färbung. Das folgende Protokoll beschreibt die Verfahren zur Herstellung von Hydrogele, 3D Kulturen von GBM-Zellen Patienten abgeleitet und Techniken für die biochemische Analyse zu etablieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generierung von reproduzierbaren Daten mit diesem 3D Culture-System erfordert: 1) einheitliche Charge zu Charge Thiolation ha, (2) Praxis zu erreichen, effiziente Vermischung von Hydrogel-Vorstufen und Handhabung von Hydrogel Kulturen um Schäden zu vermeiden und (3) optimiert Aussaat Dichte für jede Zelllinie verwendet.
Wenn eine bestimmte Gewichtsanteil von HA in das Hydrogel gewünscht wird, bestimmt den Grad der Thiolation der HA die Crosslink-Dichte. Wir empfehlen eine konsistente Datenm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus dem NIH (R21NS093199) und der UCLA ARC 3R Award unterstützt. Unsere herzlichsten Dank gehen an das Labor von Dr. Harley Kornblum zur Bestimmung der HK301 und HK157-Zell-Linien. Wir danken auch UCLA Gewebe Pathologie Kern Labor (TPCL) für Kryoschneiden, Advanced Light Microscopy/Spektroskopie zentrale Einrichtung (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) an der UCLA für den Einsatz in der konfokalen Mikroskopie, UCLA Crump Institut für Molekulare Bildgebung für die Verwendung von IVIS-imaging-System, UCLA Molekulare Instrumentierung Center (MIC) für die Magnet-Resonanz-Spektroskopie und Flow Cytometry Kern in Jonsson umfassenden Cancer Center (Zusammenkunft) an der UCLA für die Bereitstellung von Messtechnik für Durchfluss zytometrie.
Materials
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
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