Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.
Summary
Burada, üç boyutlu kültür glioblastoma hasta elde edilen hücre içinde uygun tunable Biyomalzeme beyin matris taklit etmek için tasarlanmış bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir vitro, in vivo glioblastoma hücre kültüründe genellikle kayıp birçok özelliklerini korur deneysel platformu sağlar.
Abstract
Glioblastoma (GBM) en yaygın henüz en ölümcül, merkezi sinir sistemi kanseri de öyle. Son yıllarda, birçok çalışma nasıl benzersiz beyin çevre, hyaluronik asit (HA), gibi hücre dışı matriks (ECM) GBM ilerleme ve işgal kolaylaştırır üzerinde odaklanmıştır. Ancak, çoğu vitro kültür modelleri dışında bir ECM kapsamında GBM hücre içerir. GBM hücre fare xenografts de yaygın olarak kullanılır. Ancak, in vivo modelleri karmaşık tümör microenvironment tümör davranış özelliklerini tek tek katkılarıyla ayırmak zor hale. Burada, araştırmacılar bağımsız olarak HA konsantrasyon ve sertliği değiştirmek sağlar bir HA hidrojel tabanlı, üç boyutlu (3D) kültür platformu açıklayın. Yüksek molekül ağırlıklı HA ve Polietilen glikol (PEG) çapraz Michael-türü ek huzurunda canlı hücreleri ile olan hydrogels oluştururlar. Hasta kaynaklı GBM hücreleri sergi canlılığı ve nükleer silahların yayılmasına karşı 3D hidrojel kültürleri oranları kadar iyi, ya da standart olarak gliomaspheres kültürlü zaman daha iyi. Hidrojel sistem ayrıca belirli hücre-ECM etkileşimleri etkileri yalıtmak için ECM mimetic peptidler birleşmesiyle sağlar. Böylece canlı hücreleri 3D kültüründe görüntüsü Hydrogels optik saydamdır. Son olarak, HA hidrojel kültürler moleküler ve hücresel analizleri, PCR, Western blot ve ayirt boyama tarafından takip cryosectioning gibi standart teknikleri ile uyumludur.
Introduction
Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri yerli dokularda onların iki boyutlu (2D) karşılıkları1,2daha iyi hücreleri ve onların çevreleyen hücre dışı matriks (ECM) arasındaki etkileşimler özetlemek. Doku mühendisliği gelişmeler yeni 1) nasıl kimyasal ve fiziksel bileşenleri kontrollü soruşturmalar matris microenvironment etkileyen hücre davranışları ve 2) etkinliğini sağlayan gelişmiş, 3D kültür platformlar vermiştir terapötik hastalıkları, kanserler2de dahil olmak üzere bir dizi için stratejiler. Vitro modelleri sinyalleri, endokrin ve bağışıklık gibi sistemik faktörler sorumlu olamadığınız ve böylece tamamen vivo içinde modelleri yerini alamaz iken, tekrarlanabilirlik, deneysel kontrol dahil olmak üzere çeşitli avantajları sağladıkları, uygun fiyatta ve hız. Burada, beyin mimetic hydrogels hangi 3D kültürler hasta kaynaklı Beyin tümör hücrelerinin tümör fizyolojisi, özellikle, tedavi direnç3edinme dinamikleri, bir çok yönünü yakalamak nasıl kullanılacağını açıklar. Diğer vitro yöntemlerine göre bu kültürler daha iyi vivo içinde tümör modelleri ve klinik gözlemler3temsil eder.
Glioblastoma (GBM) sadece 1-2 yıl4,5medyan sağkalım ile beyin kaynaklanan en sık ve öldürücü kanser olduğunu. Son yıllarda, birçok çalışma tümör matris çevre GBM6,7,8etkisi üzerinde odaklanmıştır. Benzersiz beyin ECM GBM hücre göç, yayılmasını önleme ve tedavi direnci6,7,8,9,10,11 etkiler bildirilmiştir , 12. hyaluronik asit (HA) nerede diğer GAGs ile etkileşim ve proteoglikanlar forma hidrojel benzeri bir kafes13beyin içinde bir bol glikozaminoglikan (GAG) olduğunu. Birçok çalışma GBM tümörler HA overexpression ve sonraki etkileri kanser ilerleme8,9,13,14,15,16 bildirdin ,17. Diğer ECM bileşenleri de GBM tümör büyüme ve işgal6,7,15,18etkiler. Örneğin, genellikle GBM içinde overexpressed, fibronektin ve vitronectin, heterodimerization hücre yüzey integrin reseptörlerinin bağlama “RGD” diziye aracılığıyla teşvik ve tümör hayatta kalma19 teşvik karmaşık sinyalleşme cascades başlatmak ,20,21. Biyokimyasal etkileri yanı sıra doku matris fiziksel özellikleri de GBM ilerleme22,23etkiler.
Sürekli terapiler direnç GBM ölümcül4ana sürücülerden biri değil. 2D veya gliomasphere modellerinde umut verici sonuçlar uyuşturucu sonraki hayvan çalışmaları ve klinik durumlarda3microenvironmental faktörlerin etkileri önemli ölçüde GBM tümör yanıt1olarak katkıda gösteren, başarısız oldu. Hayvan modelleri 3D sağlarken, fizyolojik microenvironment xenografted hasta hücrelere uygun ve klinik sonuçları24,25, beyin microenvironment in vivo karmaşıklığı oluşturmak Bu hücre-matris arasındaki etkileşimleri dahil olmak üzere özellikleri, belirli anahtar biyolojik sonuçları olduğunu belirlemek için zor yapar. Yeni tedavi hedefleri tanımlaması Biyokimya ve biyofizik özelliklerini tanımlandığı Basitleştirilmiş kültür platformlar kullanımından yararlanacaktır.
GBM tümör microenvironment26,27 daha önce bildirilen biomaterial modellerinin hangi özelliklerini tek tek fiziksel ve biyokimyasal ECM, biomaterial platformu üzerinde doğru dik kontrol elde değil GBM hücre fenotip birden çok bağımsız özellikleri katkıların bildirilen burada etkinleştirir ayırımı. Burada, hasta kaynaklı GBM hücre 3D kültür için bir HA tabanlı, uygun tunable hidrojel sistemi mevcut. Hydrogels iki polimer bileşenlerinden oluşan: 1) biyolojik olarak aktif HA ve 2) biyolojik olarak inert Polietilen glikol (PEG). PEG düşük protein adsorpsiyon ve en az immünojenisite28ile bulunan yaygın olarak kullanılan biyouyumlu ve hidrofil malzemesidir. Burada, HA ile zincir glucuronic asit moieties yaklaşık % 5’i thiol gruplarla crosslinking bir piyasada bulunan 4-kol-maleimides yolu ile Michael-türü ek ile sona PEG için etkinleştirmek için functionalized. Vücuttaki en genel haliyle, HA yüksek molekül ağırlıklı (HMW) zincirler içinde bulunmaktadır. Burada, düşük derece HMW HA (500-750 kDa) değişiklik HA ve CD4429dahil olmak üzere onun hücre reseptörleri yerli etkileşimler korumak için yardımcı olur. PEG-thiol HA-thiol için toplam thiols maleimides için bir sabit molar oranını koruyarak yerine kullanarak, HA konsantrasyonu elde edilen hydrogels mekanik özelliklerinden decoupled. Ayrıca, her 4-kol-PEG maleimide sonlandırılmış kollarda Ortalama sayıda peptidler sistein sonlandırılmış çekimlerine stokiometrik denetimleri kullanılabilir. ECM kaynaklı, yapışkanlı peptidler birleşmesiyle integrinler kültürlü hücrelerde, hangi aracılığıyla kimyasal ve biyokimyasal transduced1sinyaller ile etkileşim sağlar. Maleimide-thiol yanı sıra çok hızlı bir şekilde hücre saklama ve hasta elde edilen hücre maximizing hayatta kalmak için gereken süreyi en aza indirerek fizyolojik koşullar altında gerçekleşir. Ayrıca, hidrojel kültürler tipik doku örneği gibi tedavi edilebilir ve Western blot, akış sitometresi ve ayirt boyama gibi standart karakterizasyonu teknikleri ile uyumlu değildir. Aşağıdaki iletişim kuralı hydrogels, 3D kültürleri hasta kaynaklı GBM hücreleri ve biyokimyasal analiz teknikleri kurulması imalatı için yordamlar açıklanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu 3D kültür sistemi kullanarak tekrarlanabilir veri nesil gerektirir: 1) tutarlı toplu iş toplu iş thiolation ha, verimli hidrojel öncüleri karıştırma ve hidrojel işleme elde etmek için pratik 2) zarar önlemek için kültürler ve optimize edilmiş 3) tohum kullanılan her hücre kültürünü yoğunluğu.
HA belirli ağırlık yüzdesi hidrojel istendiğinde, crosslink yoğunluk thiolation ha derecesini belirler. Toplu iş toplu iş değişim en aza indirmek için HA her thiolat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH (R21NS093199) ve UCLA ARC 3R’s ödül fon ile desteklenmiştir. En içten teşekkürlerimizi Dr Harley Kornblum HK301 ve HK157 hücre hatları sağlanması için laboratuara gidin. Biz Ayrıca UCLA doku patoloji çekirdek Laboratuvarı (TPCL) cryosectioning için gelişmiş ışık mikroskobu/spektroskopisi çekirdek tesisi (sadaka) UCLA California Nanosystems Enstitüsü (CNSI) içinde confocal mikroskop, UCLA Institute for Crump kullanımı için teşekkür ederiz IVIS görüntüleme sistemi, UCLA moleküler araçları Merkezi (manyetik rezonans spektroskopi ve akış sitometresi çekirdek içinde Jonsson kapsamlı Kanser Merkezi (JCCC) UCLA akışı için araçları sağlamak için sağlamak için mikrofon) kullanmak için moleküler görüntüleme sitometresi.
Materials
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. . Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. 암 연구학. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 – 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
- Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
- Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
- Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
- Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. Role of hyaluronan in glioma invasion. Cell adhesion & migration. 2 (3), 202-207 (2008).
- Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
- Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
- Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
- Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
- Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
- Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
- Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
- Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
- Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
- Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
- Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
- Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
- Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
- Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman’s reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
- Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).
