Ácido hialurónico basado en hidrogeles de 3 dimensiones cultura de células de Glioblastoma derivados del paciente
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo tridimensional de células de glioblastoma derivados del paciente dentro de biomateriales ortogonalmente ajustables diseñados para imitar la matriz del cerebro. Este enfoque proporciona una en vitro, plataforma experimental que mantiene muchas características de en vivo células de glioblastoma normalmente perdidas en cultura.
Abstract
Glioblastoma (GBM) es el cáncer más común, pero más letal, del sistema nervioso central. En los últimos años, muchos estudios se han centrado en cómo la matriz extracelular (ECM) del medio cerebro único, como el ácido hialurónico (ah), facilita la invasión y la progresión de GBM. Sin embargo, la mayoría en vitro cultura modelos incluye células GBM fuera del contexto de un ECM. Murinos xenoinjertos de células GBM se utilizan comúnmente también. Sin embargo, en vivo modelos hacen difícil aislar la contribución de determinadas características del microambiente tumoral compleja al comportamiento del tumor. Aquí, describimos una plataforma de base de hidrogel, tridimensional (3D) cultura HA que permite a los investigadores modificar independientemente tiesura y la concentración de HA. Alto peso molecular HA y polietilenglicol (PEG) son hidrogeles, que son reticulado por adición tipo Michael en presencia de células vivas. Culturas de hidrogel 3D del paciente derivado GBM células muestra viabilidad y proliferación tasas tan buena como o mejor que cuando se cultivan gliomaspheres como estándar. El sistema de hidrogel también permite la incorporación de péptidos miméticos de ECM para aislar los efectos de las interacciones célula-ECM específicas. Los hidrogeles son ópticamente transparentes que células vivas pueden ser reflejadas en la cultura 3D. Por último, HA hidrogel culturas son compatibles con técnicas estándar de análisis moleculares y celulares, incluyendo PCR, Western Blot y cryosectioning seguido manchando de la inmunofluorescencia.
Introduction
Sistemas de cultivo (3D) tridimensional recapitulan las interacciones entre las células y su matriz extracelular circundante (ECM) en los tejidos nativos mejores que sus dos dimensiones (2D) homólogos1,2. Los avances en ingeniería tisular han dado plataformas 3D, sofisticada cultura que permitan nuevas investigaciones controladas en componentes físicos y químicos 1) cómo la Matriz microambiente afectan células comportamientos y 2) eficacia de terapéutica estrategias para un número de enfermedades, incluyendo cáncer2. Mientras que en vitro modelos no pueden explicar por factores sistémicos, tales como señales de endocrinos e inmunes y por lo tanto no pueden sustituir completamente en vivo modelos, ofrecen varias ventajas incluyendo reproducibilidad, control experimental, accesibilidad y velocidad. Aquí, describimos el uso de hidrogeles cerebro mimética en que 3D, cultivos de células de tumor de cerebro paciente derivado capturan muchos aspectos de la fisiología del tumor, en particular, la dinámica de adquirir tratamiento resistencia3. En comparación con otros métodos en vitro , estas culturas representan mejor en vivo tumor modelos y observaciones clínicas3.
Glioblastoma (GBM) es el cáncer más frecuente y letal que origina en el cerebro, con una supervivencia media de sólo 1-2 años4,5. En los últimos años, muchos estudios se han centrado en la influencia del entorno de la matriz del tumor en GBM6,7,8. El ECM cerebro único se ha divulgado para afectar la migración celular GBM, proliferación y resistencia terapéutica6,7,8,9,10,11 , 12. ácido hialurónico (ah) es un abundante glicosaminoglicano (GAG) en el cerebro, donde interactúa con otros GAGs y proteoglicanos para formar un hidrogel como malla13. Muchos estudios han reportado HA sobreexpresión en tumores GBM y sus efectos posteriores sobre cáncer progresión8,9,13,14,15,16 ,17. Otros componentes del ECM también afectan GBM tumor invasión y crecimiento6,7,15,18. Por ejemplo, fibronectina y vitronectina, que típicamente son overexpressed en GBM, inducen heterodimerization de receptores celulares de superficie de integrinas a través de unión a la secuencia de “Servicios” e inician complejas cascadas de señalización que promueven la supervivencia del tumor19 ,20,21. Además de influencias bioquímicas, propiedades físicas de la matriz del tejido también afectan GBM progresión22,23.
Adquisición continua de la resistencia a las terapias es uno de los principales impulsores de GBM mortalidad4. Drogas que muestran resultados prometedores en modelos 2D o gliomasphere han fracasado en posteriores estudios en animales y casos clínicos3, indicando que los efectos de factores microambiental contribuyeron significativamente a GBM tumor respuesta1. Mientras que los modelos animales pueden proporcionar un 3D, fisiológicamente apropiado microambiente a las células de pacientes investigaciones y generar resultados clínicamente relevantes24,25, la complejidad del cerebro microambiente en vivo hace difícil para determinar que características, incluyendo las interacciones célula-matriz, son los resultados biológicos claves específicos. Identificación de nuevas dianas terapéuticas se beneficiará de la utilización de plataformas de cultura simplificado en el que se definen propiedades bioquímicas y biofísicas.
A diferencia de los modelos de biomaterial previamente divulgados del GBM tumor microambiente26,27 que no han logrado cierto control ortogonal sobre determinadas características bioquímicas y físicas de la ECM, la plataforma de biomaterial reportado aquí permite la disociación de las contribuciones de múltiples funciones de independiente al fenotipo de la célula GBM. Aquí, presentamos un sistema de hidrogel basado en HA, ortogonalmente regulables, para cultura 3D de células derivadas del paciente GBM. Los hidrogeles están formados de dos componentes de polímero: HA 1) biológicamente activa y 2) biológicamente inerte polietilenglicol (PEG). PEG es un ampliamente utilizado material biocompatible e hidrofílico con adsorción baja en proteínas y de inmunogenicidad mínima28. Aquí, aproximadamente el 5% de moléculas de ácido glucurónico en cadenas HA son funcionalizado con grupos tiol para reticulación en una 4-brazo-clavija comercialmente disponible con maleimides vía la adición tipo Michael. En su forma más común en el cuerpo, HA existe en cadenas de alto peso molecular (HMW). Aquí, un bajo grado de modificación de HMW HA (500-750 kDa) ayuda a conservar las interacciones nativas de HA y sus receptores celulares, incluyendo CD4429. Sustituyendo PEG-tiol tiol HA manteniendo una constante relación molar de tioles totales a maleimides, HA concentración puede ser disociada de propiedades mecánicas de los hidrogeles resultantes. Además, pueden utilizarse controles estequiométricos conjugar terminó de cisteína de péptidos a un número definido de promedio de brazos maleimida terminado en cada 4-brazo-PEG. Incorporación de péptidos derivados de ECM, adhesivo permite interacción con integrinas en las células cultivadas, a través del cual las señales bioquímicas y químicas son transduced1. Además de maleimida-tiol se produce muy rápidamente en condiciones fisiológicas, minimizando el tiempo requerido para la encapsulación de la célula y maximizar la supervivencia de células derivadas del paciente. Por otra parte, las culturas hidrogel pueden tratarse como espécimen de tejido típico y son compatibles con técnicas de caracterización estándar incluyendo Western Blot, citometría de flujo y tinción de inmunofluorescencia. El siguiente protocolo describe el procedimiento para la fabricación de los hidrogeles, establecer cultivos 3D de células derivadas del paciente GBM y técnicas de análisis bioquímico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generación de datos reproducibles mediante este sistema de cultivo 3D requiere: 1) constante-lotes thiolation de la HA, 2) práctica para lograr la mezcla de precursores de hidrogel eficiente y manejo del hidrogel culturas para prevenir daños y 3) optimizado siembra densidad para cada línea celular utilizada.
Cuando se desea un porcentaje del peso de la HA en el hidrogel, el grado de thiolation de HA determina la densidad de reticulación. Se recomienda utilizar una cantidad constante de HA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado con fondos de los NIH (R21NS093199) y Premio de 3R de arco UCLA. Nuestro agradecimiento más sincero al laboratorio del Dr. Harley Kornblum para provisión de las líneas celulares HK301 y HK157. También agradecemos a UCLA tejido patología base laboratorio (TPCL) para cryosectioning, instalaciones de centrales avanzadas luz microscopia/espectroscopia (limosna) en el Instituto de nanosistemas de California (CNSI) en UCLA para el uso del microscopio confocal, UCLA Crump Institute for La proyección de imagen molecular para el uso de sistema de proyección de imagen de IVIS, UCLA Molecular instrumentación Center (MIC) por espectroscopia de resonancia magnética y núcleo de citometría de flujo en Jonsson comprensivo cáncer Center (JCCC) en UCLA para proporcionar instrumentación para flujo Citometría.
Materials
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
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