히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한
Summary
여기, 우리 두뇌 매트릭스를 모방 하도록 설계 하는 기가 가변 생체 내의 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한 프로토콜을 제시. 이 접근 한 생체 외에서세포종 세포 vivo에서 일반적으로 문화에서 길을 잃 었의 많은 특성을 유지 하는 실험 플랫폼을 제공 합니다.
Abstract
세포종 (GBM)은 가장 일반적인, 그러나 가장 치명적인, 중추 신 경계 암 이다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구는 어떻게는 세포 외 기질 (ECM) 히 알루 론 산 (HA) 등 독특한 두뇌 환경의 용이 GBM 진행 및 내 습에 집중 했다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 문화 모델 GBM 세포는 ECM의 컨텍스트 외부 포함. GBM 셀 murine xenografts 또한 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 모델 어렵게 종양 동작으로 복잡 한 종양 microenvironment의 개별 특징의 기여를 분리. 여기, 우리는 하 하이드로 겔-기반, 3 차원 (3D) 문화 플랫폼 연구원 하 농도 및 강성 독립적으로 변경할 수 있도록 설명 합니다. 높은 분자량 HA 및 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)는 마이클 형 추가 라이브 세포의 존재를 통해 가교 된 hydrogels를 구성 됩니다. 3D 하이드로 겔 문화 환자 파생 GBM 세포 전시 생존 및 확산의 속도 만큼 좋은, 또는 때 교양으로 표준 gliomaspheres 보다 더 있습니다. 하이드로 겔 시스템은 또한 특정 세포-ECM 상호 작용의 효과 분리 하는 ECM 모방 펩 티 드의 수 있습니다. Hydrogels 광학 투명는 라이브 셀 3D 문화에 몇 군데 있습니다. 마지막으로, 하 히드로 문화 분자 및 세포 분석, PCR, 등 서 부 럽 cryosectioning 뒤에 면역 형광 염색 법에 대 한 표준 기술로 호환 됩니다.
Introduction
3 차원 (3D) 문화 시스템 기본 조직 그들의 2 차원 (2D) 대응1,2보다 더 나은에서 셀과 그들의 주변 세포 외 기질 (ECM) 간의 상호 작용을 정리. 조직 공학의 발전은 새로운 매트릭스 microenvironment 영향 셀 동작 및 2)의 효능의 1) 어떻게 화학 및 물리적 구성 요소에 대 한 제어 조사를 가능 하 게 하는 정교한, 3D 문화 플랫폼 굴복 했다 치료 질병, 암2등의 숫자에 대 한 전략. 생체 외에서 모델 조직 요인, 내 분 비 및 면역 신호, 등에 대 한 계정이 없습니다 따라서 완전히 vivo에서 모델을 대체할 수 없습니다 하는 동안 그들은 재현성, 실험 제어를 포함 하 여 몇 가지 장점을 제공합니다 경제성 그리고 속도입니다. 여기, 우리 두뇌 모방 hydrogels는 3d에서 환자 파생 뇌 종양 세포의 문화 종양 생리학, 특히, 치료 저항3취득의 역학의 여러 측면을 캡처를 사용 하 여를 설명 합니다. 체 외에 다른 방법에 비해, 이러한 문화는 더 나은 종양 모델 vivo에서 및 임상 관찰3을 나타냅니다.
세포종 (GBM)은 1-2 년4,5의 메디아 생존으로 뇌에서 가장 빈번 하 고 치명적인 암 이다. 최근 몇 년 동안, 많은 연구는 GBM6,,78종양 매트릭스 환경의 영향에 집중 했다. 독특한 두뇌 ECM GBM 셀 이동, 확산, 그리고 치료 저항6,7,8,9,,1011 에 영향을 미칠 것으로 보고 되었습니다. , 12. 히 알루 론 산 (HA) 두뇌, 그것은 다른 개 그와 상호 작용 및 하이드로 겔 같은 한 형태로 proteoglycans 메쉬13에 풍부한 glycosaminoglycan (개 그)입니다. HA overexpression에 GBM 종양 및 암 진행8,9,13,,1415,16에 후속 효과 많은 연구 보고 ,17. 다른 ECM 구성 요소 GBM 종양 성장과 침공6,7,,1518에 영향을 줍니다. 예를 들어 fibronectin 및 vitronectin, GBM에 overexpressed 일반적으로, “RGD” 시퀀스에 대 한 바인딩을 통해 세포 표면 integrin 수용 체의 heterodimerization를 유발 하 고 종양 생존19 홍보 하는 복잡 한 신호 폭포를 시작 ,,2021. 생 화 학적 영향 외에 조직 매트릭스의 물리적 특성 GBM 진행22,23에 영향을 줍니다.
치료에 저항을의 지속적인 수집 GBM 치4의 주요 드라이버 중 하나입니다. 2D 또는 gliomasphere 모델에서 유망한 결과 보여주는 마약 이후 동물 연구와 임상 사례3, microenvironmental 요인의 효과 GBM 종양 응답1에 크게 기여 했다는 것을 나타내는 데 실패 했습니다. 동물 모델 3D를 제공할 수 있는, 순수 microenvironment xenografted 환자 세포에 적절 한 고 임상 관련 결과24,25, 두뇌 microenvironment에는 vivo에서 의 복잡성을 생성 기능, 세포-매트릭스 상호 작용을 포함 하 여 특정 핵심 생물 학적 결과 확인 하기 위해 도전 하기가. 새로운 치료 대상의 단순화 된 문화 플랫폼 생화학 및 생물 속성 정의 사용 하 여에서 도움이 됩니다.
GBM 종양 microenvironment26,27 의 이전에 보고 된 소재 모델과 달리는 달성 하지 않았습니다 진정한 직교 제어할 ECM, 소재 플랫폼의 개별 생 화 학적 및 물리적 특징 보고 여기 수 있습니다 여러 개의 독립적인 기능 GBM 세포 표현 형을 기여의 분리 하 고 여기, 선물이 환자 파생 GBM 셀의 3 차원 문화에 대 한 HA 기반, 기가 가변 하이드로 겔 시스템. Hydrogels 두 폴리머 구성 요소에서 형성 된다: 1) 생물학적으로 활성 하 고 2) 생물학으로 비활성 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG). 못은 낮은 단백질 흡착과 최소한의 immunogenicity28널리 생체 및 친수성 소재. 여기, 하 체인에 glucuronic 산 moieties의 약 5%는 기능성 가교를 상업적으로 사용할 수 있는 4-팔-못 maleimides 마이클 형 추가 통해 종료를 수 있도록 thiol 그룹. 가장 일반적인 형태로 본문에, 하 고 분자량 (HMW) 체인에 존재합니다. 여기, 낮은 정도의 HMW 하의 (500-750 kDa) 수정 하 고 CD4429를 포함 하 여 그것의 세포 수용 체의 기본 상호 작용을 유지 하기 위해 도움이 됩니다. Maleimides에 총 thiols의 일정 한 어 금 니 비율을 유지 하면서 하 thiol 위한 페그 thiol를 대체 하 여 하 농도 결과 hydrogels의 기계적 성질에서 분리 될 수 있습니다. 또한, 화학 량 론 컨트롤 시스테인 종료 펩 티 드의 maleimide로 끝나는 각 4-팔-말뚝에 정의 된 평균 수 켤레를 사용할 수 있습니다. ECM 파생, 접착제 펩 티 드의 integrins는 생화학 및 화학 신호는 불리고1경작된 한 세포에와 상호 작용 수 있습니다. Maleimide-thiol 추가 셀 캡슐화 및 환자에서 파생 된 세포의 생존을 극대화 하는 데 필요한 시간을 최소화 하는 생리 적 조건 하에서 매우 빠르게 발생 합니다. 또한, 히드로 문화 일반적인 조직 표본 처럼 취급 될 수 있으며 표준 특성화 기법 등 서 부 럽, cytometry, 면역 형광 염색 법와 호환. 다음 프로토콜 환자 파생 GBM 셀 및 생 화 확 적인 분석에 대 한 기술 3D 문화 수립 hydrogels 날조를 위한 절차를 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 3D 문화 시스템을 사용 하 여 재현할 수 데이터의 생성이 필요 합니다: 1) 일관 된 배치-배치 thiolation HA, 효율적인 히드로 선구자의 혼합 및 히드로의 처리를 달성 하기 위해 연습 2)의 손상을 방지 하기 위해 문화 및 3) 최적화 된 시드 각 셀 라인 사용에 대 한 밀도입니다.
특정 무게 비율 하는 하이드로 겔에서 원할 때 하의 thiolation의 정도 crosslink 밀도를 결정 합니다. 각 thiola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (R21NS093199)와 UCLA 아크 3R의 수상에서 자금을 지원 했다. 우리의 충심으로 감사 합니다는 HK301 및 HK157 셀 라인의 제공에 대 한 닥터 할리 로드의 실험실으로 이동합니다. 우리 또한 감사 UCLA 조직 병리학 코어 연구소 (TPCL) cryosectioning, 고급 조명 현미경/분광학 핵심 시설 (연금)에서 캘리포니아 Nanosystems 연구소 (CNSI) ucla confocal 현미경, UCLA Crump 연구소의 사용에 대 한 IVIS 이미징 시스템, UCLA 분자 계측 센터 (MIC) 흐름에 대 한 계측을 제공 하기 위한 자기 공명 분광학, 및 교류 Cytometry 코어에 Jonsson 종합 암 센터 (JCCC) UCLA에서 제공를 사용 하 여에 대 한 분자 영상 cytometry입니다.
Materials
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
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