Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie
Summary
De ex vivo cultuur van botexplants kan een waardevol instrument zijn voor de studie van de botfysiologie en de mogelijke evaluatie van geneesmiddelen bij botremodellering en botziekten. Het gepresenteerde protocol beschrijft de voorbereiding en cultuur van calvarias geïsoleerd van pasgeboren muizen schedels, evenals de toepassingen ervan.
Abstract
Bot is een bindweefsel gevormd uit osteoblasten, osteocyten, en osteoclasten en een gemineraliseerde extracellulaire matrix, die het zijn kracht en flexibiliteit geeft en het in staat stelt om zijn functies te vervullen. Bot wordt continu blootgesteld aan een verscheidenheid aan stimuli, die in pathologische omstandigheden botremodelleren kunnen dereguleren. Om botbiologie en ziekten te bestuderen en potentiële therapeutische middelen te evalueren, was het noodzakelijk om in vitro en in vivo modellen te ontwikkelen.
Dit manuscript beschrijft het dissectieproces en de kweekomstandigheden van calvaria’s geïsoleerd van neonatale muizen om botvorming en de bottumormicroomgeving te bestuderen. In tegenstelling tot in vitro en in vivo modellen, dit ex vivo model maakt het behoud van de driedimensionale omgeving van het weefsel, evenals de cellulaire diversiteit van het bot, terwijl het kweken onder gedefinieerde omstandigheden om de gewenste micro-omgeving te simuleren. Daarom is het mogelijk om botremodellering en de mechanismen ervan te onderzoeken, evenals de interacties met andere celtypen, zoals de interacties tussen kankercellen en bot.
De testen hier gemeld gebruik calvarias van 5-7 dagen oude BALB / C muizen. De verkregen hemi-calvarias worden gekweekt in aanwezigheid van insuline, borstkankercellen (MDA-MB-231), of geconditioneerd medium uit borstkankercelculturen. Na analyse werd vastgesteld dat insuline nieuwe botvorming veroorzaakte, terwijl kankercellen en hun geconditioneerde medium geïnduceerde botresorptie. Het calvariële model is met succes gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek om botontwikkeling en door kanker veroorzaakte botziekten te bestuderen. Kortom, het is een uitstekende optie voor een eenvoudige, informatieve en low-cost test.
Introduction
Bot is een dynamisch bindweefsel dat verschillende functies heeft, waaronder het ondersteunen van de spieren, het beschermen van de inwendige organen en beenmerg, en het opslaan en vrijgeven van calcium en groeifactoren1,2. Om zijn integriteit en de juiste functie te behouden, botweefsel is voortdurend onder het proces van remodelleren. In het algemeen kan een cyclus van botremodelleren worden onderverdeeld in botresorptie en botvorming1. Een onbalans tussen deze twee fasen van botremodelleren kan leiden tot de ontwikkeling van botpathologieën. Ook ziekten zoals borstkanker beïnvloeden vaak de integriteit van het bot; ongeveer 70% van de patiënten in vergevorderde stadia hebben of zullen botmetastasen hebben. Wanneer borstkankercellen de botten binnenkomen, beïnvloeden ze het botmetabolisme, wat resulteert in overmatige resorptie (osteoclastische laesies) en/of vorming (osteoblastische laesies)3.
Om de biologie van botziekten te begrijpen en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, is het noodzakelijk om de mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij botremodellering. In kankeronderzoek is het essentieel om het botmetastaseproces en de relatie tot de uitgezaaide micro-omgeving te onderzoeken. In 1889 veronderstelde Stephen Paget dat metastasen optreden wanneer er compatibiliteit is tussen de tumorcellen en het doelweefsel, en suggereerde dat de uitgezaaide site afhangt van de affiniteit van de tumor voor de micro-omgeving4. In 1997 introduceerden Mundy en Guise het concept van de “vicieuze cirkel van botmetastasen” om uit te leggen hoe tumorcellen de botmicroomgeving wijzigen om hun overleving en groei te bereiken, en hoe de botmicroomgeving hun groei bevordert door calcium- en groeifactoren5,6,7te verstrekken .
Om de mechanismen te karakteriseren die betrokken zijn bij botremodelleren en botmetastase en om moleculen met mogelijk therapeutisch potentieel te evalueren, is het noodzakelijk geweest om in vitro en in vivo modellen te ontwikkelen. Deze modellen bieden momenteel echter vele beperkingen, zoals de vereenvoudigde weergave van de botmicroomgeving, en de kosten8,9. De cultuur van botexplants ex vivo heeft het voordeel dat de driedimensionale organisatie en de diversiteit van botcellen behouden blijven. Bovendien kunnen de experimentele omstandigheden worden gecontroleerd. De explant modellen omvatten de cultuur van middenvoetsbeentje botten, dijbeenhoofden, calvarias, en mandibulaire of trabecular kernen10. De voordelen van de ex vivo modellen zijn aangetoond in diverse studies. In 2009 meldden Nordstrand en medewerkers de oprichting van een cocultuurmodel op basis van de interacties tussen bot- en prostaatkankercellen11. Ook, in 2012, Curtin en medewerkers gemeld de ontwikkeling van een driedimensionaal model met behulp van ex vivo cocultures12. Het doel van dergelijke ex vivo modellen is om de omstandigheden van de botmicroomgeving zo nauwkeurig mogelijk te recreëren om de mechanismen te kunnen karakteriseren die betrokken zijn bij normale of pathologische botremodelleren en de werkzaamheid van nieuwe therapeutische middelen te evalueren.
Het huidige protocol is gebaseerd op de procedures gepubliceerd door Garrett13 en Mohammad et al.14. Neonatale muis calvaria culturen zijn gebruikt als een experimenteel model, omdat ze de driedimensionale architectuur van het bot in ontwikkeling en botcellen behouden, met inbegrip van cellen in alle stadia van differentiatie (dat wil zeggen, osteoblasten, osteoclasten, osteocyten, stromalcellen) die leiden tot volwassen osteoclasten en osteoblasten, evenals de gemineraliseerde matrix14. Het ex vivo-model vertegenwoordigt niet volledig het pathologische proces van botziekten. Echter, effecten op bot remodelleren of kanker-geïnduceerde bot osteolyse kan nauwkeurig worden gemeten.
Kortom, dit protocol bestaat uit de volgende stappen: de dissectie van calvarias van 5-7 dagen oude muizen, calvaria precultuur, calvaria cultuur toepassingen (bijv. cultuur in aanwezigheid van insuline, kankercellen of geconditioneerd medium, en zelfs agenten met therapeutisch potentieel, volgens het doel van het onderzoek), botfixatie en calvaria ontkalking, weefselverwerking, histologische analyse en resultaatinterpretatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we het protocol voor een calvarial ex vivo model om botvorming of resorptie te evalueren en om de interacties van kankercellen met calvarial muisbot te bestuderen. De kritieke stappen van deze techniek zijn de dissectie, cultuur, inbedding en histomorfoalanalyse van de calvaria’s. Tijdens de dissectie van de calvarias is het cruciaal om de hemi-calvaria’s in een trapezium te snijden, omdat het de oriëntatie tijdens de paraffineopname sterk zal vergemakkelijken. Bij het bestuderen van kankercel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Mario Nomura, MD en Rodolfo Díaz voor hun hulp bij de histologie, en Pierrick Fournier, Ph.D. voor zijn waardevolle opmerkingen om de kwaliteit van het papier te verbeteren.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. . Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A., Heymann, D. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the “seed and soil” theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
