Medición de la remodelación ósea y recreación del microambiente tumor-óseo utilizando la cocultura calvaria y la histomorfometría
Summary
El cultivo ex vivo de explantes óseos puede ser una herramienta valiosa para el estudio de la fisiología ósea y la evaluación potencial de fármacos en la remodelación ósea y enfermedades óseas. El protocolo presentado describe la preparación y el cultivo de calvarias aisladas de cráneos de ratones recién nacidos, así como sus aplicaciones.
Abstract
El hueso es un tejido conectivo constituido por osteoblastos, osteocitos y osteoclastos y una matriz extracelular mineralizada, que le da su fuerza y flexibilidad y le permite cumplir sus funciones. El hueso está continuamente expuesto a una variedad de estímulos, que en condiciones patológicas pueden desregular la remodelación ósea. Para estudiar la biología ósea y las enfermedades y evaluar posibles agentes terapéuticos, ha sido necesario desarrollar modelos in vitro e in vivo.
Este manuscrito describe el proceso de disección y las condiciones de cultivo de las calvarias aisladas de ratones neonatales para estudiar la formación ósea y el microambiente tumoral óseo. A diferencia de los modelos in vitro e in vivo, este modelo ex vivo permite la preservación del entorno tridimensional del tejido, así como la diversidad celular del hueso mientras se cultúa en condiciones definidas para simular el microambiente deseado. Por lo tanto, es posible investigar la remodelación ósea y sus mecanismos, así como las interacciones con otros tipos de células, como las interacciones entre las células cancerosas y el hueso.
Los ensayos aquí indicados utilizan calvarias de ratones BALB/C de 5-7 días de edad. Los hemi-calvarias obtenidos se cultivan en presencia de insulina, células de cáncer de mama (MDA-MB-231) o medio acondicionado de cultivos celulares de cáncer de mama. Después del análisis, se estableció que la insulina indujo nueva formación ósea, mientras que las células cancerosas y su resorción ósea inducida media condicionada. El modelo calvarial se ha utilizado con éxito en la investigación básica y aplicada para estudiar el desarrollo óseo y las enfermedades óseas inducidas por el cáncer. En general, es una excelente opción para un ensayo fácil, informativo y de bajo costo.
Introduction
El hueso es un tejido conectivo dinámico que tiene varias funciones, incluyendo el apoyo a los músculos, la protección de los órganos internos y la médula ósea, y el almacenamiento y liberación de calcio y factores de crecimiento1,,2. Para mantener su integridad y función adecuada, el tejido óseo está continuamente bajo el proceso de remodelación. En términos generales, un ciclo de remodelación ósea se puede dividir en resorción ósea y formación ósea1. Un desequilibrio entre estas dos fases de remodelación ósea puede conducir al desarrollo de patologías óseas. Además, enfermedades como el cáncer de mama a menudo afectan la integridad ósea; aproximadamente más del 70% de los pacientes en etapas avanzadas tienen o tendrán metástasis óseas. Cuando las células de cáncer de mama entran en los huesos, afectan el metabolismo óseo, lo que resulta en una resorción excesiva (lesiones osteoclásticas) y/o formación (lesiones osteoblásticas)3.
Para entender la biología de las enfermedades óseas y desarrollar nuevos tratamientos, es necesario entender los mecanismos involucrados en la remodelación ósea. En la investigación del cáncer, es esencial investigar el proceso de metástasis ósea y su relación con el microambiente metastásico. En 1889, Stephen Paget hipotetizó que las metástasis ocurren cuando hay compatibilidad entre las células tumorales y el tejido diana, y sugirió que el sitio metastásico depende de la afinidad del tumor para el microambiente4. En 1997, Mundy y Guise introdujeron el concepto del “círculo vicioso de metástasis óseas” para explicar cómo las células tumorales modifican el microambiente óseo para lograr su supervivencia y crecimiento, y cómo el microambiente óseo promueve su crecimiento proporcionando calcio y factores de crecimiento5,,6,,7.
Para caracterizar los mecanismos implicados en la remodelación ósea y metástasis ósea y para evaluar moléculas con posible potencial terapéutico, ha sido necesario desarrollar modelos in vitro e in vivo. Sin embargo, estos modelos presentan actualmente muchas limitaciones, como la representación simplificada del microambiente óseo, y su costo8,9. El cultivo de explantes óseos ex vivo tiene la ventaja de mantener la organización tridimensional, así como la diversidad de células óseas. Además, se pueden controlar las condiciones experimentales. Los modelos explantatos incluyen el cultivo de huesos metatarsales, cabezas femorales, calvarias y núcleos mandibulares o trabeculares10. Las ventajas de los modelos ex vivo se han demostrado en diversos estudios. En 2009, Nordstrand y colaboradores informaron del establecimiento de un modelo de cocultura basado en las interacciones entre las células de cáncer de hueso y próstata11. Además, en 2012, Curtin y sus colaboradores informaron del desarrollo de un modelo tridimensional utilizando los coculturas ex vivo 12. El objetivo de estos modelos ex vivo es recrear las condiciones del microambiente óseo con la mayor precisión posible para poder caracterizar los mecanismos implicados en la remodelación ósea normal o patológica y evaluar la eficacia de los nuevos agentes terapéuticos.
El presente protocolo se basa en los procedimientos publicados por Garrett13 y Mohammad et al.14. Los cultivos de calvaria sómico se han utilizado como modelo experimental, ya que conservan la arquitectura tridimensional del hueso en desarrollo y las células óseas, incluyendo células en todas las etapas de diferenciación (es decir, osteoblastos, osteoclastos, osteoclasocitos, células estromales) que conducen a osteoclastos maduros y osteoblastos, así como a la matriz mineralizada14. El modelo ex vivo no representa totalmente el proceso patológico de las enfermedades óseas. Sin embargo, los efectos sobre la remodelación ósea o la osteolisis ósea inducida por cáncer se pueden medir con precisión.
Brevemente, este protocolo consta de los siguientes pasos: la disección de calvarias de ratones de 5-7 días de edad, precultivo de calvaria, aplicaciones de cultivo de calvaria (por ejemplo, cultivo en presencia de insulina, células cancerosas o medio condicionado, e incluso agentes con potencial terapéutico, según el objetivo de la investigación), fijación ósea y descalcificación calvaria, procesamiento de tejidos, análisis histológico e interpretación de resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos el protocolo para un modelo calvarial ex vivo para evaluar la formación o resorción ósea y para estudiar las interacciones de las células cancerosas con el hueso del ratón calvarial. Los pasos críticos de esta técnica son la disección, el cultivo, la incrustación y el análisis histomorfométrico de las calvarias. Durante la disección de las calvarias, es crucial cortar el hemi-calvarias en un trapezoide, ya que facilitará fuertemente la orientación durante la inclusión de la para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Mario Nomura, M.D. y Rodolfo Díaz por su ayuda con la histología, y Pierrick Fournier, Ph.D. por sus valiosos comentarios para mejorar la calidad del trabajo.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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