カルバリア共培養と組織病量を用いた骨リモデリングと腫瘍-骨微小環境の再現
Summary
骨外植の元生体培養は、骨生理学の研究や骨のリモデリングや骨疾患における薬物の潜在的な評価のための貴重なツールとなり得る。提示されたプロトコルは、新生児マウスの頭蓋骨から分離されたカルヴァリアの調製および培養、ならびにその用途を記述する。
Abstract
骨は骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、およびミネラル化された細胞外マトリックスから構成される結合組織であり、その強さと柔軟性を与え、その機能を果たすことができます。骨は様々な刺激にさらされ続け、病理学的状態では骨のリモデリングを調節緩和することができる。骨生物学や疾患を研究し、潜在的な治療薬を評価するためには、インビトロおよびインビボモデルの開発が必要であった。
本稿では、新生児マウスから分離されたカルバリアの解剖過程と培養条件について、骨形成と骨腫瘍微小環境を研究する。インビトロおよびインビボモデルとは対照的に、このex vivoモデルは、組織の3次元環境と骨の細胞多様性を維持し、所定の条件下で培養して所望の微小環境をシミュレートすることを可能にする。したがって、骨のリモデリングとそのメカニズム、ならびに癌細胞と骨の相互作用などの他の細胞型との相互作用を調べることができます。
ここで報告されたアッセイは、5-7日齢BALB/Cマウスのカルバリアを使用する。得られたヘミカルバリアは、インスリン、乳癌細胞(MDA-MB-231)、または乳癌細胞培養から調整された培地の存在下で培養される。分析後、インスリンが新しい骨形成を誘導し、癌細胞とその調整された培地が骨吸収を誘発することを確立した。このカルバリアモデルは、骨の発達やがんによる骨疾患の研究に基礎的および応用研究に成功しています。全体的に、それは容易で、有益で、低コストのアッセイのための優秀な選択である。
Introduction
骨は筋肉を支え、内臓および骨髄を保護し、カルシウムおよび成長因子,1、2を貯蔵および放出することを含むいくつかの機能を有する動的結合組織1である。その完全性および適切な機能を維持するために、骨組織は連続的に改造のプロセスの下にある。一般に、骨リモデリングのサイクルは、骨吸収と骨形成1に分けることができる。骨のリモデリングのこれらの2つの段階の間の不均衡は、骨の病理の開発につながることができます。また、乳がんなどの病気は骨の完全性に影響を与えることが多い。進行期の患者の約70%以上が骨転移を有するか、または有するであろう。乳癌細胞が骨に入ると、それらは骨代謝に影響を及ぼし、過剰な吸収(破骨病変)および/または形成(骨芽細胞病変)3を生じる。
骨疾患の生物学を理解し、新しい治療法を開発するためには、骨のリモデリングに関わるメカニズムを理解する必要があります。がん研究では、骨転移過程と転移性微小環境との関係を調べるのが重要です。1889年、スティーブン・パジェトは、腫瘍細胞と標的組織との間に相溶性がある場合に転移が起こると仮定し、転移部位が微小環境4に対する腫瘍の親和性に依存することを示唆した。1997年、マンディとギーズは、腫瘍細胞が生存と成長を達成するために骨微小環境をどのように変えるか、そして骨微小環境がカルシウムおよび成長因子55、6、76,を提供することによってどのように成長を促進するかを説明する「骨転移の悪循環」という概念を導入した。
骨のリフォームや骨転移に関与するメカニズムを特徴付け、可能な治療可能性を有する分子を評価するためには、インビトロおよびインビボモデルの開発が必要であった。しかし、これらのモデルは現在、骨微小環境の簡略表示やコスト88、99など多くの制限を提示している。ex vivoの骨の培養は、骨細胞の多様性と同様に、立体的組織を維持するという利点を有する。また、実験条件も制御できる。外植モデルには、中足骨、大腿骨頭部、カルバリア、下顎または骨壁コア10の培養が含まれる。ex vivoモデルの利点は、多様な研究で実証されている。2009年、Nordstrandと共同研究者は、骨癌細胞と前立腺癌細胞11との相互作用に基づく共培養モデルの確立を報告した。また、2012年には、カーティンと共同研究者は、ex vivoのコカルチャー12を用いた立体モデルの開発を報告した。このようなex vivoモデルの目的は、正常または病理学的骨リモデリングに関与するメカニズムを特徴付け、新しい治療薬の有効性を評価することができるように、骨微小環境の条件を可能な限り正確に再現することです。
本議定書はギャレット13とモハマドらによって公表された手順に基づいている。新生児マウスカルバリア培養は、成熟した破骨細胞および骨芽細胞につながる分化のすべての段階(すなわち、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、間質細胞)の細胞を含む、発達中の骨および骨細胞の三次元アーキテクチャを保持するため、実験モデルとして使用されてきた。ex vivoモデルは、骨疾患の病理学的過程を完全に表すものではありません。しかし、骨のリモデリングや癌による骨骨の骨の骨の骨の骨の影響を正確に測定することができます。
簡単に言えば、このプロトコルは、5-7日齢マウスからのカルバリアの解剖、カルバリア前培養、カルバリア培養アプリケーション(例えば、インスリン、癌細胞または条件付け培地の存在下での培養、さらには薬剤の解剖)から構成される。治療上の可能性は、調査の目的に従って)骨固定およびカルバリア脱灰、組織処理、組織学的分析、および結果解釈。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、骨形成または吸収を評価し、癌細胞とカルバリア性マウスの骨との相互作用を研究するためのカルバリア式ex vivoモデルのプロトコルについて説明する。この手法の重要なステップは、カルバリアの解剖、培養、埋め込み、および組織形態測定分析である。カルバリアの解剖中、パラフィン包含中の向きを強く促進するため、ヘミカルバリアを台形に切断することが重要です…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マリオ・ノムラ、M.D.、ロドルフォ・ディアスの神学の支援、ピエリック・フルニエ博士の貴重なコメントに感謝しています。
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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