Mesurer le remodelage et la recréation du microenvironnement tumoral-os à l’aide de la co-culture Calvaria et de l’histomorphométrie
Summary
La culture ex vivo des explantations osseuses peut être un outil précieux pour l’étude de la physiologie osseuse et l’évaluation potentielle des médicaments dans le remodelage des os et les maladies osseuses. Le protocole présenté décrit la préparation et la culture des calvarias isolées des crânes de souris nouveau-nés, ainsi que ses applications.
Abstract
L’os est un tissu conjonctif constitué d’ostéoblastes, d’ostéocytes et d’ostéoclastes et d’une matrice extracellulaire minéralisée, qui lui donne sa force et sa flexibilité et lui permet d’accomplir ses fonctions. L’os est continuellement exposé à une variété de stimuli, qui dans des conditions pathologiques peuvent déréglementer le remodelage des os. Pour étudier la biologie osseuse et les maladies et évaluer les agents thérapeutiques potentiels, il a été nécessaire de développer des modèles in vitro et in vivo.
Ce manuscrit décrit le processus de dissection et les conditions de culture des calvarias isolés des souris néonatales pour étudier la formation osseuse et le microenvironnement de tumeur d’os. Contrairement aux modèles in vitro et in vivo, ce modèle ex vivo permet la préservation de l’environnement tridimensionnel du tissu ainsi que la diversité cellulaire de l’os tout en se chavant dans des conditions définies pour simuler le microenvironnement désiré. Par conséquent, il est possible d’étudier le remodelage des os et ses mécanismes, ainsi que les interactions avec d’autres types de cellules, tels que les interactions entre les cellules cancéreuses et les os.
Les essais signalés ici utilisent des calvarias de souris BALB/C vieilles de 5 à 7 jours. Les hémi-calvarias obtenus sont cultivés en présence d’insuline, de cellules cancéreuses du sein (MDA-MB-231), ou de milieu conditionné des cultures de cellules cancéreuses du sein. Après analyse, il a été établi que l’insuline a induit la nouvelle formation d’os, tandis que les cellules cancéreuses et leur résorption d’os induite par le milieu conditionné. Le modèle calvaire a été utilisé avec succès dans la recherche fondamentale et appliquée pour étudier le développement osseux et les maladies osseuses induites par le cancer. Dans l’ensemble, c’est une excellente option pour un essai facile, informatif et peu coûteux.
Introduction
L’os est un tissu conjonctif dynamique qui a plusieurs fonctions, y compris le soutien des muscles, la protection des organes internes et de la moelle osseuse, et le stockage et la libération de calcium et les facteurs de croissance1,2. Pour maintenir son intégrité et sa bonne fonction, le tissu osseux est continuellement en cours de remodelage. En termes généraux, un cycle de remodelage des os peut être divisé en résorption osseuse et formation osseuse1. Un déséquilibre entre ces deux phases de remodelage osseux peut conduire au développement de pathologies osseuses. En outre, les maladies telles que le cancer du sein affectent souvent l’intégrité osseuse; environ plus de 70 % des patients à un stade avancé ont ou auront des métastases osseuses. Lorsque les cellules cancéreuses du sein pénètrent dans les os, elles affectent le métabolisme osseux, ce qui entraîne une résorption excessive (lésions ostéoclastiques) et/ou une formation (lésions ostéoblastiques)3.
Pour comprendre la biologie des maladies osseuses et développer de nouveaux traitements, il est nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dans le remodelage des os. Dans la recherche sur le cancer, il est essentiel d’étudier le processus de métastase osseuse et sa relation avec le microenvironnement métastatique. En 1889, Stephen Paget a émis l’hypothèse que les métastases se produisent quand il y a compatibilité entre les cellules tumorales et le tissu cible, et a suggéré que le site métastatique dépend de l’affinité de la tumeur pour le microenvironnement4. En 1997, Mundy et Guise ont introduit le concept du « cercle vicieux des métastases osseuses » pour expliquer comment les cellules tumorales modifient le microenvironnement osseux pour atteindre leur survie et leur croissance, et comment le microenvironnement osseux favorise leur croissance en fournissant du calcium et des facteurs de croissance5,,6,,7.
Pour caractériser les mécanismes impliqués dans le remodelage des os et la métastase osseuse et pour évaluer les molécules ayant un potentiel thérapeutique possible, il a été nécessaire de développer des modèles in vitro et in vivo. Cependant, ces modèles présentent actuellement de nombreuses limitations, telles que la représentation simplifiée du microenvironnement osseux, et leur coût8,9. La culture des explantations osseuses ex vivo a l’avantage de maintenir l’organisation tridimensionnelle ainsi que la diversité des cellules osseuses. En outre, les conditions expérimentales peuvent être contrôlées. Les modèles explants comprennent la culture des os métatarsiens, des têtes fémorales, des calvarias et des noyaux mandibulaires ou trabecular10. Les avantages des modèles ex vivo ont été démontrés dans diverses études. En 2009, Nordstrand et ses collaborateurs ont signalé la mise en place d’un modèle de coculture basé sur les interactions entre les cellules du cancer de l’os et de la prostate11. En outre, en 2012, Curtin et ses collaborateurs ont signalé le développement d’un modèle tridimensionnel à l’aide de cocultures ex vivo 12. Le but de ces modèles ex vivo est de recréer les conditions du microenvironnement osseux aussi précisément que possible pour être en mesure de caractériser les mécanismes impliqués dans le remodelage normal ou pathologique des os et d’évaluer l’efficacité de nouveaux agents thérapeutiques.
Le protocole actuel est basé sur les procédures publiées par Garrett13 et Mohammad et coll.14. Les cultures néonatales de calvaria de souris ont été employées comme modèle expérimental, car elles conservent l’architecture tridimensionnelle de l’os sous le développement et des cellules osseuses, y compris les cellules à tous les stades de la différenciation (c.-à-d. ostéoblastes, ostéoclastes, ostéocytes, cellules stromales) qui mènent aux ostéoclastes et aux ostéoblastes matures, ainsi qu’à la matrice minéralisée14. Le modèle ex vivo ne représente pas totalement le processus pathologique des maladies osseuses. Cependant, les effets sur le remodelage des os ou l’ostéolyse osseuse induite par le cancer peuvent être mesurés avec précision.
En bref, ce protocole se compose des étapes suivantes : la dissection des calvarias de souris de 5 à 7 jours, la préculture de calvaria, les applications de la culture de la calvaria (p. ex., la culture en présence d’insuline, les cellules cancéreuses ou le milieu conditionné, et même les agents avec potentiel thérapeutique, selon le but de l’enquête), fixation osseuse et décalcification de calvaria, traitement tissulaire, analyse histologique et interprétation des résultats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons le protocole pour un modèle ex vivo calvaire pour évaluer la formation ou la résorption d’os et pour étudier les interactions des cellules cancéreuses avec l’os de souris calvaire. Les étapes critiques de cette technique sont la dissection, la culture, l’intégration et l’analyse histomorphométrique des calvarias. Pendant la dissection des calvarias, il est crucial de couper l’hémi-calvarias en trapézoïde, car il facilitera fortement l’orientation pendant l’inclusion …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Mario Nomura, M.D. et Rodolfo Daaz pour leur aide à l’histologie, et Pierrick Fournier, Ph.D. pour ses précieux commentaires visant à améliorer la qualité du papier.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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- Clark, R. K. . Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).
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