שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה
Summary
התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.
Abstract
עצם היא רקמת חיבור היוו האוסטאופאוקיים, אוסטאופציטים, ו osteoclasts ו מטריצה החילוץ מינרליזציה, אשר נותן לו את כוחה וגמישות ומאפשר לו להגשים את תפקידיה. עצם הוא נחשף ברציפות למגוון של גירויים, אשר בתנאים פתולוגיים יכול deregulate העצם שיפוץ. כדי ללמוד ביולוגיה של עצם ומחלות ולהעריך את הסוכנים הטיפוליים הפוטנציאליים, יש צורך לפתח בתוך מבחנה ובמודלים vivo .
כתב יד זה מתאר את תהליך הניתוח ותנאי התרבות של calvarias מבודדים מעכברי המין לחקור את היווצרות העצם ואת מיקרוסביבה הגידול בעצם. בניגוד למבחנה במודלים vivo , זה לשעבר מודל vivo מאפשר שימור של הסביבה תלת ממדית של הרקמה, כמו גם את הגיוון הסלולר של העצם תוך הימנעות תחת תנאים מוגדרים כדי לדמות את מיקרוהסביבה הרצויה. לכן, ניתן לחקור את שיפוץ העצם ואת המנגנונים שלה, כמו גם את האינטראקציות עם סוגי תאים אחרים, כגון האינטראקציות בין תאים סרטניים ועצם.
הבחני דיווחו כאן להשתמש calvarias מ 5-7 ביום הישן balb/C עכברים. המי-calvarias שהתקבלו הם מתורבתים בנוכחות של אינסולין, תאי סרטן השד (מד א-MB-231), או בינוני ממוזג מתרביות תאים של סרטן השד. לאחר הניתוח, זה הוקם כי אינסולין המושרה היווצרות העצם החדשה, בעוד תאים סרטניים המדיום הממוזג שלהם המושרה ספיגת העצם. מודל כיפת בוצע בהצלחה במחקר בסיסי ויישם כדי ללמוד פיתוח עצם ומחלות העצם המושרה בסרטן. באופן כללי, זוהי אפשרות מצוינת עבור שיטת קל, אינפורמטיבי, ובעלות נמוכה.
Introduction
עצם היא רקמת חיבור דינמית שיש לה מספר פונקציות, כולל תמיכה השרירים, הגנה על האיברים הפנימיים מח עצם, ואחסון ושחרור של סידן וגורמי גדילה1,2. כדי לשמור על שלמות ותפקוד תקין, רקמת העצם היא ברציפות תחת תהליך של שיפוץ. במונחים כלליים, מחזור של שיפוץ עצם ניתן לחלק לספיגת עצם היווצרות העצם1. חוסר איזון בין שני שלבים אלה של שיפוץ העצם יכול להוביל להתפתחות של הפתווגיות העצם. כמו כן, מחלות כגון סרטן השד משפיעים לעתים קרובות על שלמות העצם; כ 70% של חולים בשלבים מתקדמים יש או יהיה גרורות העצם. כאשר התאים סרטן השד להזין את העצמות, הם משפיעים על מטבוליזם העצם, וכתוצאה מכך ספיגת מוגזם (נגעים אוסטקלאסטיים) ו/או היווצרות (נגעים osteoblastic)3.
כדי להבין את הביולוגיה של מחלות העצם ולפתח טיפולים חדשים, יש צורך להבין את המנגנונים המעורבים בעיצוב מחדש של העצם. במחקר הסרטן, זה חיוני לחקור את התהליך גרורות העצם הקשר שלה מיקרוסביבה גרורתית. בשנת 1889, סטיבן פאג’ט שיערו כי גרורות מתרחשות כאשר יש תאימות בין תאי הגידול לבין רקמת היעד, והציע כי האתר גרורתי תלוי בזיקה של הגידול עבור מיקרוסביבה4. ב 1997, מונדי וגיז הציגו את המושג “מחזור אכזרי של גרורות העצם” כדי להסביר כיצד תאים סרטניים לשנות את מיקרוסביבה העצם כדי להשיג ההישרדות שלהם צמיחה, ואיך מיקרוסביבה העצם מקדמת את הצמיחה שלהם על ידי מתן סידן וגורמי צמיחה5,6,7.
כדי לאפיין את המנגנונים המעורבים בעיצוב העצם וגרורה, ולהעריך מולקולות בעלי פוטנציאל תרפויטי אפשרי, יש צורך לפתח בתוך מבחנה ובמודלים vivo . עם זאת, מודלים אלה מציגים כיום מגבלות רבות, כגון הייצוג הפשוט של מיקרואקולוגיה העצם, והעלות שלהם8,9. התרבות של vivo העצם explants ex יש את היתרון של שמירה על ארגון תלת מימדי, כמו גם מגוון של תאי העצם. בנוסף, ניתן לשלוט בתנאים ניסיוניים. המודלים לחקור כוללים את התרבות של עצמות המסרק, ראשי הירך, calvarias, ו הלסת התחתונה או בליבת העור10. היתרונות של מודלים vivo ex הוכחו במחקרים שונים. בשנת 2009, נורסטרנד ומשתפי-פעולה דיווחו על הקמת מודל התרבות הבין-תרבותית המבוססת על האינטראקציות בין העצמות לתאי סרטן הערמונית11. גם, ב 2012, Curtin ומשתפי פעולה דיווחו על פיתוח של מודל תלת מימדי באמצעות vivo cocultures ex 12. המטרה של מודלים vivo ex לשעבר היא לשחזר את התנאים של סביבת מיקרו העצם באופן מדויק ככל האפשר כדי להיות מסוגל לאפיין את המנגנונים המעורבים בעיצוב שיפוץ נורמלי או פתולוגי בעצם ולהעריך את היעילות של הסוכנים הטיפוליים החדשים.
הפרוטוקול הנוכחי מבוסס על ההליכים שפורסמו על ידי גארט13 ומחמד ואח ‘.14. התרבויות הcalvaria העכברים שימשו מודל ניסיוני, כפי שהם שומרים על הארכיטקטורה תלת מימדי של העצם תחת פיתוח ותאי עצם, כולל תאים בכל שלבי הבידול (כלומר, אוסטאופיות, אוסטאופאוקיים, אוסטאופציטים, סטרומה תאים) זה להוביל אוסטאופתיות בוגרת האוסטאופתיות, כמו גם מטריצה מינרליזציה14. המודל vivo ex אינו מייצג את התהליך הפתולוגי של מחלות העצם לחלוטין. עם זאת, השפעות על שיפוץ העצם או העצמות המושרה העצם אוסטאופוליזיס יכול להיות נמדד במדויק.
בקצרה, פרוטוקול זה כולל את השלבים הבאים: הניתוח של calvarias מ 5-7 הישן ביום עכברים, calvaria טרום תרבות, calvaria יישומי תרבות (למשל, תרבות בנוכחות של אינסולין, תאים סרטניים או בינוני ממוזג, ואפילו סוכנים עם פוטנציאל תרפויטי, על פי מטרת החקירה), קיבוע עצם וcalvaria decalcification, עיבוד רקמות, ניתוח היסטולוגית, ופרשנות התוצאה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור מודל vivo לשעבר כיפת להערכת היווצרות העצם או ספיגת וללמוד את האינטראקציות של תאים סרטניים עם עצם העכבר כיפת. הצעדים הקריטיים של טכניקה זו הם הניתוח, התרבות, ההטבעה, ו היפוסטומיטריקל אנליזה של calvarias. במהלך הניתוח של calvarias, זה חיוני לחתוך את המי-calvarias לתוך ט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים מריו Nomura, md ו Rodolfo דיז על עזרתם עם היסטולוגיה, ופירט פורנייה, Ph.D. על הערות יקרות שלו כדי לשפר את איכות הנייר.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. . Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A., Heymann, D. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the “seed and soil” theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
