Medição da remodelagem óssea e recriação do microambiente tumor-osso usando a cocultura da Calvaria e a histomormormetria
Summary
A cultura ex vivo de explantas ósseas pode ser uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia óssea e a avaliação potencial de medicamentos na remodelagem óssea e doenças ósseas. O protocolo apresentado descreve a preparação e a cultura de calvarias isoladas de crânios de camundongos recém-nascidos, bem como suas aplicações.
Abstract
Osso é um tecido conjuntivo constituído de osteoblastos, osteócitos e osteoclastos e uma matriz extracelular mineralizada, o que lhe dá sua força e flexibilidade e permite que ele cumpra suas funções. O osso é continuamente exposto a uma variedade de estímulos, que em condições patológicas podem desregulamentar a remodelagem óssea. Para estudar biologia óssea e doenças e avaliar potenciais agentes terapêuticos, é necessário desenvolver modelos in vitro e in vivo.
Este manuscrito descreve o processo de dissecção e as condições de cultura das calvarias isoladas dos camundongos neonatais para estudar a formação óssea e o microambiente do tumor ósseo. Em contraste com os modelos in vitro e in vivo, este modelo ex vivo permite a preservação do ambiente tridimensional do tecido, bem como a diversidade celular do osso enquanto cultura condições definidas para simular o microambiente desejado. Assim, é possível investigar a remodelagem óssea e seus mecanismos, bem como as interações com outros tipos de células, como as interações entre células cancerígenas e osso.
Os ensaios aqui relatados usam calvarias de ratos BALB/C de 5 a 7 dias de idade. As hemi-calvarias obtidas são cultivadas na presença de insulina, células cancerígenas de mama (MDA-MB-231), ou meio condicionado a partir de culturas de células cancerígenas de mama. Após análise, foi estabelecido que a insulina induziu nova formação óssea, enquanto as células cancerosas e sua reabsorção óssea média condicionada. O modelo calvarial tem sido usado com sucesso em pesquisas básicas e aplicadas para estudar o desenvolvimento ósseo e doenças ósseas induzidas pelo câncer. No geral, é uma excelente opção para um ensaio fácil, informativo e de baixo custo.
Introduction
O osso é um tecido conjuntivo dinâmico que possui várias funções, incluindo apoiar os músculos, proteger os órgãos internos e a medula óssea, e armazenar e liberar fatores de cálcio e crescimento1,2. Para manter sua integridade e função adequada, o tecido ósseo está continuamente o processo de remodelação. Em termos gerais, um ciclo de remodelagem óssea pode ser dividido em reabsorção óssea e formação óssea1. Um desequilíbrio entre essas duas fases de remodelagem óssea pode levar ao desenvolvimento de patologias ósseas. Além disso, doenças como o câncer de mama geralmente afetam a integridade óssea; aproximadamente mais de 70% dos pacientes em estágio avançado têm ou terão metástases ósseas. Quando as células cancerígenas de mama entram nos ossos, elas afetam o metabolismo ósseo, resultando em reabsorção excessiva (lesões osteoclásticas) e/ou formação (lesões osteoblásticas)3.
Para entender a biologia das doenças ósseas e desenvolver novos tratamentos, é necessário compreender os mecanismos envolvidos na remodelagem óssea. Na pesquisa do câncer, é essencial investigar o processo de metástase óssea e sua relação com o microambiente metastático. Em 1889, Stephen Paget supôs que as metástases ocorrem quando há compatibilidade entre as células tumorais e o tecido alvo, e sugeriu que o local metastático depende da afinidade do tumor para o microambiente4. Em 1997, Mundy e Guise introduziram o conceito de “ciclo vicioso de metástases ósseas” para explicar como as células tumorais modificam o microambiente ósseo para alcançar sua sobrevivência e crescimento, e como o microambiente ósseo promove seu crescimento fornecendo cálcio e fatores de crescimento5,6,7.
Para caracterizar os mecanismos envolvidos na remodelagem óssea e na metástase óssea e avaliar moléculas com potencial terapêutico possível, é necessário desenvolver modelos in vitro e in vivo. No entanto, esses modelos apresentam atualmente muitas limitações, como a representação simplificada do microambiente ósseo, e seu custo8,9. A cultura das explantas ósseas ex vivo tem a vantagem de manter a organização tridimensional, bem como a diversidade de células ósseas. Além disso, as condições experimentais podem ser controladas. Os modelos de explante incluem a cultura de ossos metatarsos, cabeças femorais, calvarias e núcleos mandibulares ou trabeculares10. As vantagens dos modelos ex vivo têm sido demonstradas em diversos estudos. Em 2009, Nordstrand e colaboradores relataram o estabelecimento de um modelo de cocultura baseado nas interações entre células cancerígenas ósseas e de próstata11. Além disso, em 2012, Curtin e colaboradores relataram o desenvolvimento de um modelo tridimensional utilizando coculturas ex vivo 12. O objetivo desses modelos ex vivo é recriar as condições do microambiente ósseo com a maior precisão possível para poder caracterizar os mecanismos envolvidos na remodelagem óssea normal ou patológica e avaliar a eficácia de novos agentes terapêuticos.
O presente protocolo baseia-se nos procedimentos publicados por Garrett13 e Mohammad et al.14. Culturas de calvaria neonatal do rato têm sido utilizadas como modelo experimental, pois mantêm a arquitetura tridimensional do osso em desenvolvimento e células ósseas, incluindo células em todos os estágios de diferenciação (ou seja, osteoblastos, osteoclastos, osteócitos, osteócitos, células estrômicas) que levam a osteoclastos maduros e osteoblastos, bem como a matriz mineralizada14. O modelo ex vivo não representa totalmente o processo patológico das doenças ósseas. No entanto, os efeitos na remodelagem óssea ou na osteólise óssea induzida pelo câncer podem ser medidos com precisão.
Resumidamente, este protocolo consiste nas seguintes etapas: dissecção de calvarias de camundongos de 5 a 7 dias de idade, pré-cultura calvariada, aplicações de cultura calvariada (por exemplo, cultura na presença de insulina, células cancerosas ou meio condicionado, e até mesmo agentes com potencial terapêutico, segundo o objetivo da investigação), fixação óssea e decalcificação da calvaria, processamento de tecidos, análise histológica e interpretação de resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos o protocolo para um modelo calvarial ex vivo para avaliar a formação ou reabsorção óssea e estudar as interações das células cancerígenas com osso do rato calvarial. Os passos críticos dessa técnica são a dissecção, cultura, incorporação e análise histomorfométrica das calvarias. Durante a dissecção das calvarias, é crucial cortar a hemi-calvarias em um trapézio, pois facilitará fortemente a orientação durante a inclusão da parafina. Ao estudar as interações das cél…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Mario Nomura, M.D. e Rodolfo Díaz pela ajuda com a histologia, e Pierrick Fournier, Ph.D. por seus valiosos comentários para melhorar a qualidade do artigo.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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