Summary
Här beskriver vi generationen och tillämpning av en uppsättning transgena Arabidopsis thaliana linjer möjliggörande inducerbara, vävnadsspecifika uttryck i de tre huvudsakliga meristems, av skjuta apical meristem, av roten apical meristem och Kambium.
Abstract
Inducerbara, vävnadsspecifika uttryck är ett viktigt och kraftfullt verktyg för att undersöka genetisk störning plats och tid dynamik. Kombinera den flexibla och effektiva GreenGate kloning system med beprövade och benchmarking LhGR systemet (här kallas GR-LhG4) för inducerbara uttrycket, har vi genererat en uppsättning transgena Arabidopsis linjer som kan köra uttrycket av en effektor kassett i en rad specifika celltyper i de tre viktigaste växt meristems. Därför valde vi i tidigare utvecklade GR-LhG4 system baserat på en chimär transkriptionsfaktor och cognate pOp-typ förespråkare att säkerställa tight kontroll över ett brett spektrum av uttryck nivåer. Dessutom för att visualisera uttryck domänen där den syntetiska transkriptionsfaktor är aktiv, är en ER-lokaliserad mTurquoise2 fluorescerande reporter under kontroll av promotorn pOp4 eller pOp6 kodad i drivrutinen linjer. Här, beskriver vi stegen som krävs för att generera en drivrutin eller effektor linje och demonstrera hur cellen typ uttryck kan inducerad och följt av skjuta apical meristem, av roten apical meristem och cambium av Arabidopsis. Med hjälp av flera eller alla förare linjer, sammanhang effekten att uttrycka en eller flera faktorer (effektorer) under kontroll av syntetiska pOp arrangören kan bedömas snabbt, till exempel i F1 växter av en korsning mellan en effektor och flera drivrutinen linjer. Detta tillvägagångssätt exemplifieras av ektopisk uttryck för VND7, en NAC transkriptionsfaktor kan framkalla ektopisk sekundär cell wall nedfall i en cell självständigt sätt.
Introduction
En stor begränsning i biologi i den postgenomic eran är att dechiffrera sammanhang specifika roll en given faktor eller genetisk störning. Konstituerande genetiska störningar såsom förlust-av-funktion och gain-of-function strategier ofta endast tillåta slutpunkten analys av livslångt anpassning processer, fördunklar distinktionen mellan primära och sekundära effekter. Dessutom kan sammanhang specifika funktioner maskeras eller utspädd av storskaliga effekter i avlägsna vävnader eller under övriga faser av utveckling. Dessutom i extrema fall, kan dödlighet hindra någon mekanistisk insikt. Idealiskt, för att kringgå dessa frågor, kan man analysera effekten av akut genetisk störning inom ett visst sammanhang såsom en viss celltyp i en tid-löst sätt. För att uppnå detta, är genetiska verktyg för inducerbara, cell typspecifika uttryck krävs1. För att ge en resurs för snabb bedömning av spatiotemporal dynamiken i ett svar på en viss effektor, har vi kombinerat lättheten av kloning som tillhandahålls av GreenGate system2 med beprövade effekten av GR-LhG4 system3, 4,5,6. Vi har skapat en uppsättning rader som uttrycker den chimära Transkriptionfaktorn LhG4 smält till ligand bindande domänen av råtta kortikoid receptor (GR)7 under kontroll av välkarakteriserad cell typ specifika initiativtagare8. I vilande tillstånd, förblir transkriptionsfaktor utanför cellkärnan, som GR domänen är bunden av den cytosoliska HSP90. Med tillägg av syntetiska ligand dexametason (Dex), translokationen i cellkärnan induceras och LhG4 kommer att medla transkription av uttrycket kassetter under kontroll av ett cognate syntetiska pOp-typ Promotorn, såsom en mTurquoise2 reporter ingår i raderna föraren att visualisera domänen uttryck efter induktion. Således driver raderna tekniskt innehåller också en effektor-kassett. Passage av en uppsättning driver linjerna med en linje som bära en effektor kassett med, till exempel en gen av intresse under samma pOp-typ Promotorns kontroll således tillåter snabb bedömning av de akuta eller långsiktiga konsekvenserna av effektor uttryck i en mängd olika celltyper.
Här, tillhandahåller vi ett protokoll som beskriver förfarandena som är nödvändiga att generera raderna drivrutin och effektor och demonstrera hur cellen typ uttryck kan inducerad och följt av skjuta apical meristem, av roten apical meristem och cambium av Arabidopsis. För att illustrera den skicklighet och specificitet av denna strategi, vi använder den välkända transkriptionsfaktor VND7 som kan köra xylem-liknande sekundär cell wall thickenings ectopically9. Behandling av F1 från en korsning mellan pSCR10,11 driver linjen och pOp6:VND7 effektor linjen leder till bildandet av ektopisk xylem-liknande celler i stärkelse skidan celler av de Arabidopsis stam.
Om du vill underlätta genereringen av stora DNA-sammansättningar som krävs för att konstruera drivrutin och effektor uttryck plasmider, använde vi den snabbt och effektivt GreenGate kloning metod2. GreenGate kloning är baserat på typ II S restriktionsenzym såsom Eco31I eller dess isoschizomer BsaI2. Dessa enzymer skära downstream av deras asymmetriska erkännande webbplatser producerar överhäng med varierande bas sammansättning. Genom att införliva Eco31I /Bsajag begränsning platser i oligonukleotider och att tilldela specifika överhäng sekvenser till DNA-element, modulära kloning uppnås, att underlätta genereringen av stora sammanställningar. Inom ramen för GreenGate faller DNA moduler kategorier A-F baserat på överhäng sekvens som fungera som adaptrar och är monterade i den ordningen. Primers för att förstärka din önskade produkt bör därför enligt vald modul i2 (figur 1A). Om det finns en inre Eco31I /Bsajag webbplats och sekvensen är inte kompatibel med modulerna GreenGate inträde och destination, kan du gå vidare utan mutagenizing, men med lägre effektivitet. Alternativt använda webbplats riktad mutagenes ta bort Eco31I /Bsajag begränsning platser utan för att ändra aminosyror i genprodukter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vektorer och moduler kan erhållas från ideella databasen, Addgene (https://www.addgene.org).
1. kloning använder GreenGate
- Design grundfärger med överhäng anges i tabell 1, ersätta 'NNNN' med modul typspecifika adapter sekvenser som anges nedan: fram: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + sekvensk 3´, omvänd: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + omvänd komplement till specifik sekvens 3´. Lägg till de understrukna baserna för att säkerställa underhållet av ramen läsning.
Modulen överhäng:
Obs: I standard GreenGate ramen, sex moduler, A-F, är monterade med en växt förvandling vektor ryggrad i ett uttryck i plasmiden (figur 1 c). Typiskt, A modulen kommer harbor arrangören sekvenser, en B-modul en N-terminal tagg eller ”dummy” sekvens6, en C-modul en CD, en D-modul en C-terminal tagg eller dummy, en E-modul en terminator och en F-modul en motstånd kassett för urval av transgena växter. Adapter för koppling med andra förmonterade enheter är tillgängliga för användning i stället för den F modul2. - PCR-amplifiering
- Förstärka sekvensen av intresse med designade primers av polymeras-kedjereaktion (PCR) enligt standardprotokoll.
- Separat PCR-produkten på en agarosgel. Punktskatter och kolumn rena rätt fragmentet med hjälp av ett kommersiellt kit (se Tabell för material) enligt tillverkarens instruktioner.
- Inträde modul skapande
- Separat smälta modul vektorn och PCR-fragmentet (steg 1.2.) (Figur 1 A, B) med Eco31I/Bsajag använder 100-500 ng DNA (vektor eller Fragment), 3 µL 10 x matsmältningen buffert och 5-10 U Eco31I i ett rör och få 30 µL med ddH2O. volymen
- Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner och varva ner kort på 1 000 x g. Inkubera vid 37 ° C på en värme block för 15 min (eller efter tid rekommendation av den köpta restriktionsenzym).
- Efter matsmältningen, rena kolumn varje prov med en kommersiell kit (se Tabell av material) och kvantifiera den erhållna DNA genom att bestämma den optiska densiteten vid 260 nm (OD260) med en spektrofotometer.
- Mix 30 – 100 ng rötas infoga och 10 – 50 ng rötas vektorn av pipettering upp och ner flera gånger och inkubera med 1 µL T4 Ligase (5 U/µL och 3 µL 10 x T4 ligering buffert i en total volym på 30 µL vid rumstemperatur för 1 h (efter rekommendation T4 ligase leverantörens) (se Tabell för material).
Obs: Beräkna önskad molar förhållandet posten modul: destination vektorn (t.ex. 3:1) för ligering beroende på koncentration och längden på posten modul skären. - För att öka effektiviteten i omvandling, inaktivera värme den T4 ligase genom ruvning reaktionen vid 65 ° C i 20 min.
- Använd produktens ligering att omvandla behöriga E. coli celler enligt standard lab protokoll och sprida bakterier på agarplattor kompletteras med ampicillin (100 µg/mL)
- Inkubera plattan med bakterier vid 37 ° C för övernattning.
- Skärmen för kolonier med modulen önskad post av kolonin PCR med hjälp av primers 86A1 (5′-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3′) och 86A2 (5′-GTTTTCCCAGTCACGACG-3′) och PCR standardvillkor.
Obs: Denna primer kombination är giltig för alla intrade moduler som primers binder till posten vektor ryggraden. - Markera enstaka kolonier för plasmid isolering. Använd 2 mL LB flytande kultur kompletteras med ampicillin (100 µg/mL) och inkubera över natten i en 37 ° C shaker.
- Isolera plasmider från övernattning flytande kultur med en mini Prep Kit eller önskad extraktion protokoll (se Tabell för material).
- För att identifiera plasmider med rätta skäret, utföra restriktionsenzym analys, till exempel genom att välja två enzymer som skär unikt i din infoga genom att blanda 200 ng av plasmid, 2 µL 10 x matsmältningen buffert, 5-10 U av utvalda restriktionsenzym och ddH2 O till 20 µL.
- Sekvensera de valda plasmider som med hjälp av primers 86A1 och 86A2 (se punkt 1.3.9.).
- Destination modul skapande:
Obs: För destination plasmiden använda önskad destination modul pGGZ001, pGGZ002 eller pGGZ0032 (figur 1 c).- I en tub tillsätt och blanda 50 – 150 ng Tom destination vektor (pGGZ003, till exempel), 50-300 ng varje fyllde posten modul, 2 µL 10 x matsmältningen buffert buffert, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL), 5-10 U µL Eco31I och dH2O till en total volym av 20 µl.
Obs: Beräkna önskad molar förhållandet posten modul: destination vektorn (t.ex. 3:1) för ligering beroende på koncentration och längden på posten modul skären. - Blanda och utföra den GreenGate reaktion2 med hjälp av en PCR termocykler omväxlande 30 gånger mellan 37 ° C i 5 min och 16 ° C i 2 min, följt av enstaka steg 5 min vid 50 ° C och 5 min vid 80 ° C.
- För att öka effektiviteten, tillsätt 1 µL T4 Ligase (30 U/µL) och 1,5 µL 10 mM ATP till reaktionen och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur, följt av värme-inaktivering av T4 DNA-Ligase vid 65 ° C i 20 min.
- Använd ligering reaktionen att omvandla behöriga E. coli och sprida bakterier på agarplattor kompletteras med lämplig selektiv agent Spektinomycin (50 µg/mL).
- Inkubera den transformerade E. coli på plattan vid 37 ° C för övernattning.
- För att bekräfta omvandling, åter strimma var och en av de valda enda kolonierna på Spektinomycin (50 µg/mL) och ampicillin (100 µg/mL) som innehåller plattor, respektive. Använd endast kolonier som växer på Spektinomycin men inte på ampicillin plattor.
- Inkubera i E. coli kolonier över natten vid 37 ° C.
- Markera enstaka kolonier för plasmid isolering. Använd 2 mL LB flytande kultur kompletteras med Spektinomycin (50 µg/mL) och inkubera över natten vid en 37 ° C shaker.
- Isolera de motsvarande plasmidsna med en mini Prep Kit (se Tabell för material).
- Kontrollera av restriktionsenzym analys (se 1.3.12.) och sekvens valt positiva konstruktioner med hjälp av primers 88C 3 (5′-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3′), 88C 4 (5′-CCTTTTTACGGTTCCTG-3′). Om insatsen inte kan sekvenseras fullt med dessa grundfärger, utforma interna primers för sekvensering.
Obs: Att identifiera kloner med rätt antal pOp upprepa sekvenser (se diskussion), de grundfärger pOp6 (pOp6_F, 5′-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3′; och pOp6Triton, 5′-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3′) som binder i den kort sagt flankerande sekvenser kan användas för PCR-amplifiering och efterföljande gelelektrofores för att diskriminera efter storlek.
- I en tub tillsätt och blanda 50 – 150 ng Tom destination vektor (pGGZ003, till exempel), 50-300 ng varje fyllde posten modul, 2 µL 10 x matsmältningen buffert buffert, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL), 5-10 U µL Eco31I och dH2O till en total volym av 20 µl.
- Mellanliggande supermodule skapande
- Att kombinera två oberoende uppsättningar med posten moduler, som krävs för att generera GR-LhG4 driver raderna med integrerad reporter-effektor kassett, första bygga två mellanliggande plasmider, kallas supermodules2, innan montering det slutliga uttrycket Plasmid i pGGZ001 eller pGGZ003.
- Glöm inte att lägga till F-H adapter i slutet av den första supermodule och H-A adaptern i början av den andra supermodule (dem tjäna som anslutningar mellan två konstruktioner) som beskrev2.
Obs: Endast pGGN000 mellanliggande modulen bär motstånd kassett. För att generera uttryck plasmiden, utföra GreenGate reaktionen med destination vektorn och de pGGN000 och pGGM000 mellanliggande supermodules. Alternativt kan du blanda destination vektor, pGGN000 mellanliggande supermodule och de återstående enstaka modulerna till utföra den GreenGate reaktion2. Den senare metoden är mindre effektiva än det förra men kan vara snabbare. - För att skapa en pGGM000/pGGN000 supermodule, blanda 1,5 µL (100-300 ng/µL) av de post-modulerna med 1 µL (30 ng/µL) Tom mellanliggande vektor (pGGM000 eller pGGN000), 2 µL 10 x matsmältningen buffert, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL) , och 5-10 U Eco31I i en total volym på 20 µL.
Obs: Beräkna önskad molar förhållandet posten modul: destination vektorn (t.ex. 3:1) för ligering beroende på koncentration och längden på posten modul skären - Blanda och utföra GreenGate reaktionen som i steg 1.4.2
- För att öka effektiviteten, tillsätt 1 µL T4 Ligase och 1,5 µL ATP (10 mM), och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur, följt av värmeinaktivering vid 65 ° C i 20 min.
- Använda 10 µL av ligering reaktionen för att omvandla behöriga E. coli och streak på plåtar som innehåller kanamycin (50 µg/mL).
- Utföra natten inkubation av den transformerade E. coli på plattan vid 37 ° C.
- Nytt strimma vardera av de valda enda kolonierna på kanamycin (50 µg/mL) och ampicillin (100 µg/mL) innehåller plattor, respektive.
- Utföra natten inkubation av E. coli kolonier på plattan vid 37 ° C.
- Markera enstaka kolonier som växer endast på kanamycin men inte på ampicillin plasmid isolering. Använd 2 mL LB flytande kultur kompletteras med kanamycin (50 µg/mL) och inkubera över natten i en 37 ° C shaker.
- Isolera de motsvarande plasmider som använder en mini prep kit (se Tabell för material).
- Kontrollera plasmidsna genom restriktionsenzym analys (se 1.3.12.) och bekräfta genom sekvensering använda primers 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) och 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) glödgning till pGGM000/pGGN000 stamnätet. Om insatsen inte kan sekvenseras fullt med dessa grundfärger, utforma interna primers för sekvensering.
Obs: Om kloning i pGGM000 eller pGGN000 vektorer misslyckas en möjlig lösning är att smälta den pGGM000 eller pGGN000 med Eco31I, kör på en gel och rena från gelen pGGM000 eller pGGN000 ryggraden (cirka 2000 bp) fragmentet utan den ccdB kassett (cirka 1400 bp). Fortsätt sedan normalt med ligering reaktionen.
- Förvandla en A. tumefaciens pSOUP+ stam (t.ex. ASE), som pSa ursprung replikering (ori A. tum.) i destination vektorer kräver närvaro av helper plasmiden pSOUP12. Strimma ut bakterier på LB plåtar som innehåller kloramfenikol (34 µg/mL), kanamycin (50 µg/mL), Spektinomycin (50 µg/mL) och tetracyklin (12,5 µg/mL). Inkubera den omvandlade A. tumefaciens på plattan i en inkubator i 28 ° C i två till tre dagar.
2. generering av Arabidopsis transgena växter
- Omvandling av Arabidopsis thaliana.
Obs: Omvandla A. thaliana växter enligt Zhang et al., 200613. - Urval av transgena linjerna.
- Välj de transformerade växterna, använda urval systemet används GABI-Kat14 för resistens mot sulfadiazin15.
- Du väljer stabil rader med en enda som möjligt integrera händelsen, klicka på dem i generationen T2, som visar förhållandet 3:1 segregering i motstånd markören. Sprida dessa rader till T3 generation och välj växterna som är homozygota för genen motstånd. Alternativt utföra en analys för södra Blot eller en standard kvantitativa realtids PCR (SA-qPCR)16 att välja enda införande linjer.
3. induktion av trans-aktivering i Arabidopsis driver linjer
- Root
- Att testa reporter uttryck i A. thaliana driver rader genereras genom steg 1 och 2, sterilisera frön som beskrivs nedan.
- Lägga till 0,5-1,0 mL 70% etanol + 0,01% icke-joniskt rengöringsmedel till ca 100 frön (20 mg) i en 1,5 ml reaktionsröret och Invertera röret några gånger. Snurra ner vid 1000 x g i 15 s och aspirera supernatanten.
- Lägga till 0,5-1,0 mL absolut etanol. Vänd röret flera gånger, snurra ner för 1 000 x g för 15 s och Kassera supernatanten.
- Lägga till 0,5-1,0 mL absolut etanol och Invertera tube t några gånger, sedan snurra ner vid 1 000 x g i 15 s och Kassera supernatanten.
- Låt fröna torka inuti huven. Om frön ska vara skiktade i rör fortsätter du med steg 3.1.1.6.
- Lägga till 0,5-1,0 mL sterilt vatten och Invertera röret ett par gånger. Snurra ner vid 1 000 x g i 15 s och Kassera supernatanten.
- Lägga till 0,5-1,0 mL sterilt vatten och Invertera röret flera gånger. Snurra ner vid 1 000 x g i 15 s och Kassera supernatanten.
- Lägga till 0,5-1,0 mL sterilt vatten.
- Förbereda halv-styrka Murashige och Skoog medium, pH 5.8 och lägga till 0,9% växt agar och 1% sackaros. När autoklavering lägger till dexametason (Dex), upplöst i DMSO, till en slutlig koncentration av 10-30 µM till Induktionshällen och en lika stor mängd DMSO till kontrollplattor, respektive.
- Sätter frön för roten avbildning på tallrikar och stratifiera dem för 48 h i mörker och kyla (4 ° C).
- Lägga plattor vertikalt i en växt inkubator (lång dag (16/8 h), 22 ° C, luftfuktighet, 65%) och odla dem i fem dagar.
- Fem dagar efter groning (dag), image plantor med confocal microscopy för laserscanning.
- Att testa reporter uttryck i A. thaliana driver rader genereras genom steg 1 och 2, sterilisera frön som beskrivs nedan.
- Stem
- Sterilisera frön som beskrivs i 2.1.1. och sätta frön på ½ MS, 0,9% växt agar och 1% sackaros plattor. Stratifiera för 48 h i mörker och kyla (4 ° C).
- Sex till sju dagar efter groning, överföra plantorna att jord, varje planta i en enda pott (lång dag (16/8 h), 22 ° C, luftfuktighet, 65%).
- Inducera trans-aktivering i stjälkar av vattning med Dex eller håna lösning, eller genom att doppa plantorna i Dex eller håna lösningar, respektive.
- För vattning, använda en 25 µM Dex lösning i vatten beredd från ett lager av 25 mM Dex löst i etanol. Vatten varje 2-3 dagar tills önskad tid med induktion.
- För doppning, förbereda en 1-litersbägare, 750 mL vatten som innehåller 0,02% silwet L-77 med 25 µM Dex eller motsvarande mängd DMSO för Dex och håna behandling, respektive. Doppa enstaka plantor till 30 s i induktion eller håna lösningen. Upprepa var 2-3 dagar tills önskad tid för bildframställning.
Obs: Efter den doppning, växterna bör bibehållas i hög luftfuktighet i en timme.
- Skjuta Apical Meristem (SAM)
- Sterilisera frön som beskrivs i 2.1.1. Förbereda plattor med ½ MS, 0,9% växt agar och 1% sackaros medium och sätta frön på tallrikar. Förvara plattorna under två dagar i mörker och kyla för stratifiering.
- Lägga plattor vertikalt i en växt inkubator. Sex till sju dagar efter groning, överföra plantor till marken, varje planta i en enda pott (lång dag (16/8 h), 22 ° C, luftfuktighet, 65%).
- När stammen är ca 1 cm lång (25-30 dag), spraya Blomställningen SAM med 10-50 µM Dex i H20 bära en ansiktsmask. För induktion och tänkbar på senare stadier av utveckling, framkalla SAMs längre stjälkar eller sidoskott.
Obs: SAMs kan också induceras av paintbrushing Dex lösningen att förhindra spray droppar. Använd en mask när Dex appliceras genom sprutning. - 24-48 h efter induktion, dissekera SAMs och gå vidare till imaging (se 4.3).
Obs: Endast un-inducerad växter användes för förökning för att minska sannolikheten för nedtystning. Växter i T2/T3 användes för avbildning.
4. avbildning av reporter uttryck i Arabidopsis driver linjer.
- Root
- Överför plantor från plattan till en 10 µg/mL propidium jodid (PI) lösning och motverka fläckar dem för 5 min.
- Placera rötterna i Mikroskop imaging kammare (1-Jo vävnadsodling kammare på täckglaset II, se Tabell av material) och bild dem med en confocal laserscanning Mikroskop med en 63 x vatten nedsänkning mål (se Tabell för material).
- För att visualisera PI fluorescens, Använd en magnetisering våglängd av 488 nm och samla utsläpp mellan 590 och 660 nm. För mTurquoise2 fluorescens Använd 458 nm excitation och samla utsläpp mellan 460 och 615 nm.
- Stem
- Utföra horisontella hand skära sektioner av växt stjälkar med ett rakblad, excising ett segment på cirka 3 cm. fixa stammen med fingret på motsatt sida av önskat avsnitt att skära. Utföra flera fina snitt sekventiellt men observera att endast delar från en liknande position i stammen bör jämföras.
- Efter varje snitt, fördjupa razorblade i en petriskål innehållande kranvatten och samla avsnitten stam. Bets sektioner på denna punkt eller montera direkt på objektglas.
- För färgning, förbereda en 1 mL 250 µg/mL PI lösning av vatten i en liten petriskål (se Tabell för material). Sänk ner avsnitten för 5 min och skölj dem i vatten. Överföra dem till objektglas med fin pincett eller en fin pensel. Var noga med att inte pressa av prov med täckglaset.
- Bild exempel med en confocal laserscanning Mikroskop med en 25 x doppning vatten nedsänkning lins (se Tabell för material). Använd 561 nm laserljus att excitera PI fluorescens och samla in från 570 till 620 nm. Användning 405 nm att excitera den mTurquoise2 fluorophore effektor kodas av föraren linje konstruktioner och samla in utsläpp från 425 till 475 nm.
- Skjuta Apical Meristem
- Skär av stjälken 2 cm nedanför skjuta spetsen med pincett. Håll stjälken i en hand och använda fin pincett för att ta bort blomknoppar och stora primordia. Ta bort unga primordia, fixa SAM upprätt i en petriskål som innehåller 3% agaros. Använda en kikare och pincett för att ta bort unga primordia nära SAM. Alternativt använda en injektion kanyl (se Tabell för material) för att skära av dessa primordia.
- Bets dissekerade SAM i en 250 µg/mL PI lösning för 5-10 min. utför färgning antingen direkt genom pipettering några droppar färgning lösning ovanpå beredda SAM eller överför provet till en tub fylld med färgning lösning. Hålla SAM helt nedsänkt under förfarandet för färgning.
- Placera de färgade SAM i en liten petriskål (se Tabell för material) med 3% agaros medium och täck SAM med ddH2O.
- Bild dissekeras SAMs med hjälp av en confocal laser skanning Mikroskop utrustat med en 25 x doppning vatten nedsänkning lins (se Tabell för material).
- Använd 561 nm laserljus att excitera PI fluorescens och samla in från 570 till 620 nm. Användning 405 nm att upphetsa mTurquoise2 fluorophore och samla utsläpp från 425 till 475 nm.
Spela in bildstaplar spanning 50 µm i z-riktningen med en stegstorlek på 0,5 µm.
Obs: SAM imaging som beskrivs här kräver en upprätt confocal laserscanning Mikroskop och en lins (här, en vatten doppning lins) med långa arbetsavstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generation av föraren och effektor linjer genom GreenGate kloning
Den GreenGate kloning systemet bygger på GoldenGate kloning och använda den typ IIS begränsning Amiiiiin Bsajag eller dess isoschizomer Eco31I. Eftersom enzymet producerar överhäng avlägsen från dess asymmetriska erkännande, bas sammansättningen av överhäng kan vara fritt bildar valda, vilket är grunden Modulariteten av systemet. Varje PCR-genererade element, till exempel en arrangören sekvens, CD-skivor eller terminator, sätts först in en utsedda posten vektor med matchande överhäng produceras av begränsning digest att generera en modul. Efter subkloning används ett antal matchande moduler, vanligt sex, för GreenGate ligering reaktionen vilket resulterar i församlingen av konstruktionen i ett binärt växt destination vektor.
För föraren linjer, moduler som innehåller de DNA-sekvenserna av vävnad-specifika Promotorn (pTS), GR-LHG4 Transkriptionfaktorn, pOp6 arrangören och mTurquoise2 reportern smält till en N-terminal signal peptid och en C-terminal ER retention signal var smält inklusive termineringar och olika adapter moduler och en modul för transgena urval som tidigare beskrivits 2,8 (figur 2). Effektor raderna konstruerades med pOp6 Promotorn och en effektor kassett, till exempel bestående av en gen av intresse och terminator samt en modul kodning en motstånd gen för transgena växter urval (figur 2).
Induktion av drivrutinen linjer och visualisering av reporter fluorescens
Induktion med Dex leder till cell typ specifika mTurquoise2 uttryck i roten Endodermisen (pSCR>> SP-mTurquoise2-HDEL, figur 3A), phloem prekursorer och Kambium (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, Figur 3B), och stamcellerna i den skjuta apical meristemen (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, figur 3 c).
Trans-aktivering av VND7 i stärkelse slida celler i cambium
Som ett testfall för trans-aktivering genererade vi en effektor linje kodning av sekundär cell wall master transkriptionsfaktor VND7 smält till VP16 aktiveringen domänen, vilket har visats inducera sekundära cell wall bildandet cell självständigt när misexpressed 8,9,19,20.
Efter 5 dagar av en enda behandling med antingen 15 µM Dex eller DMSO för den inducerade eller håna växterna respektive var stam sektioner förberedda för visualisering av ektopisk lignification i stärkelse skidan. Propidium jodid visar i stammen stark affinitet till lignifierad vävnad. Stärkelse slida cellerna i inducerad prover av Dex, men inte i den mock visade en stark signal för kanalen PI och vissa celler visar de typiska nätaktigt förtjockning av cellväggen i xylem celler (figur 4).
Figur 1. Den GreenGate kloning principen. A) typ IIS begränsning endonucleases, liksom Bsajag /Eco31I, erkänna icke-palindromiska sekvenser (röd) och skär asymmetriskt i ett definierat avstånd oberoende av sekvensen (blå). Eco31I erkänner 'GGTCTC', skär från den andra nukleotid nedströms av webbplatsen erkännande och skapar en fyra bas 5' överhäng. (B) den GreenGate kloning systemet bygger på ett modulsystem med sex olika post vektorer pGGA000-pGGF000. Dessa vektorer innehåller en Ampicillin motstånd kassett (AmpR) och en ccdB kassett flankerad av särskilda adaptrar för varje post vektor (e.g pGGA000 inträde vector) och 'GGTCTC' Eco31I erkännande platser. Eco31I nedbrytning av pGGA000 släpper ccdB och skapar pGGA000-specifika fyra nukleotid överhäng (mörkblå). Insert1 förstärks av primrar härbärgerat 'GGTCTC' och pGGA000 särskilda adaptrar och efter matsmältningen sammanskrivna i pGGA000. Samma förfarande följs med andra moduler. (C) den slutliga GreenGate reaktionen kombinerar Eco31I nedbrytning av den destination vektor pGGZ001 och de sex posten vektorer pGGA000-pGGF000 och den samtidiga ligering av alla moduler i den destination vektorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Översikt över systemets Dex-inducerbara LhGR/pOp med föraren och effektor linjer. i föraren linjer, vävnadsspecifika initiativtagare (pTS) styr uttrycket av den syntetiska transkriptionsfaktor LhG4, som smälts translationally ligand bindande domän råtta glukokortikoidreceptorn (GR) och därmed förhindrar, i avsaknad av Dex, translokationen i cellkärnan. Effector linjen hamnar en transkriptionell kassett som drivs av ett pOp -element och en TATA-box med en minimal 35S -promotor. Korsas med en drivrutin linje och vid Dex induktion, binder GR-LhG4 till pOp-typ elementen i reporter kassett och till dem i modulen effektor inducerande transkriptionen av mTurquoise2 och effektor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Inducerad driver linjer i rot, stam och SAM. A) Dex-inducerad driver linjen pSCR >>SP-mTurquoise2-HDEL (grodde i 50 µM Dex) i roten och håna behandling. Promotorn FÅGELSKRÄMMAN (pSCR) förmedlar uttryck i Endodermisen, cortex/Endodermisen inledande (CEI) och quiescent center (QC). Celler är kontra färgas med propidium jodid (PI). Skala barer = 20 µm. B) Dex-inducerad driver linjen pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (doppad i en 50 µM Dex lösning och visualiseras efter 3 dagar) i i stammen och håna behandling. SMXL5 arrangören (pSMXL5) förmedlar uttryck i cambium stamceller domän och floem prekursorer. Celler är kontra färgas med propidium jodid (PI). Skala barer = 100 µm. C) Dex-inducerad driver linjen pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 µM, 48 h) i SAM. CLAVATA3 arrangören (pCLV3) förmedlar uttryck i domänen stamceller. Bilderna längst ned visar XZ och YZ tvärsnitt, Dex-inducerad och håna behandlas, respektive. Celler är kontra färgas med propidium jodid (PI). Skala barer = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. Ektopisk lignification i stärkelse skidan av stammen. A) ektopisk lignification är sett fem dagar efter Dex induktion av raden föraren pSCR >> VND7-VP16 i stammen. Promotorn FÅGELSKRÄMMAN (pSCR) förmedlar uttryck i stärkelse slida cellerna i stammen. Vänstra bilden visar sammanslagning av PI kanal och ljusa fält, högra bilden visar endast PI kanal. (B) kontrollen håna visar ingen signal i stärkelse slida cellerna. Celler är kontra färgas med propidium jodid (PI). Skala barer = 100 µm. PI fluorescens är false-färgade i grönt medan kloroplast auto fluorescens är röd i alla bilder. Vita pilar peka stärkelse slida celler. Vänstra bilden visar sammanslagning av PI kanal och ljusa fält, högra bilden visar endast PI kanal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Modul | 5' överhäng | används vanligtvis för | 3' överhäng |
| A | ACCT | arrangören | AACA |
| B | AACA | N-terminala tagg | GGCT |
| C | GGCT | Kodande sekvens | TCAG |
| D | TCAG | C-terminal tagg | CTGC |
| E | CTGC | Terminator | ACTA |
| F | ACTA | motstånd kassett | GTAT |
Tabell 1: Överhäng används för primer design
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, vi beskriver stegen för att skapa och tillämpa en mångsidig och omfattande verktygslåda för inducerbara, cell typ specifika trans-aktivering. Passerar linjer som transporterar effektor kassetter under kontroll av promotorn pOp med drivrutinen linjer kan studera mis uttryck effekter i F1-generationen, möjliggör en snabb bedömning av genetisk störning i en rad olika celltyper. Alternativt, effektor konstruktioner kan användas för att omvandla driver linjer eller genom att anpassa kloning strategi, föraren och effektor konstruktion kan också kombineras på en T-DNA. Ansökningar om detta system spänner från spatialt och temporalt kontrollerade mis uttryck studier som domän-specifika knock-down eller gen redigering och celltyp specifika komplettering.
Ingen av de förfaranden som beskrivs här bör utgöra en utmaning för labs utrustade för allmänna molekylärbiologiska tekniker. LhG4 uttryck systemet har testats grundligt och ser icke-läckande och samma uttryck som kan drivas på hög nivå8, även om vi försiktighet att det dynamiska omfånget av inducerare koncentration empiriskt bör bestämmas för varje förare och effektor linje kombination kombinerar detta beprövade system med modulära GreenGate kloning erbjuder en snabb och enkel väg till inducerbara uttryck i vilken celltyp som en särskild promotor är tillgänglig. Vi märkte att rekombination händelser kan inträffa under förstärkning av plasmidsna som innehåller repetitiva sekvenser av promotorn pOp-typen . Dessa resulterar ofta i att ha färre repetitioner av OP sekvensen, som kan bedömas genom PCR. Slutliga konstruktioner bör alltid bekräftas av sekvensering i Escherichia coli och Agrobacterium tumefaciens. Dock upptäcktes endast enstaka rekombination händelserna i E. coli.
Begränsa tillämpningen av denna teknik är alltså tid att generera transgena växter. Det är av avgörande betydelse att testa för gene silencing, start i T2 generation, och endast upprätthålla stabila linjer. För att minimera risken för ljuddämpning, rekommenderar vi att samla frön endast form icke-inducerad växter.
Den teknik som beskrivs här är gratis till andra trans-aktiveringen system21,22, eftersom det ger en omfattande resurs och kombinerar vävnadsspecificitet med inducerbara uttryck. En möjlig framtida utveckling av denna metod är införlivandet av fler cell typspecifika initiativtagare till drive GR-LhG4, till exempel i vävnader utanför de huvudsakliga meristems. Angående effektorer är en spännande möjlighetutvidgningen anpassning av högeffektiva gen redigeringsverktyg för cell typspecifika knock outs23.
De driver linjerna beskrivs i Schürholz et al. 20188 finns tillgängliga från NASC (http://arabidopsis.info/), DNA konstruktioner beskrivs i Lampropoulos et al., 20132 och Schürholz et al., 20188 är tillgängliga från Addgene (https://www.addgene.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Arbete i våra laboratorier stöds av tyska Research Foundation (DFG) bidrag WO 1660/6-1 (till S.V.) och GR 2104/4-1 (till T.G.) och SFB1101 (till T.G. och J.U.L) och av ett europeiskt forskningsråd consolidator bevilja (PLANTSTEMS 647148) till T.G. S.V. stöds genom Emmy Noether gemenskap av DFGEN genom Grant WO 1660/2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
