使用抗生素耐药性平台进行抗生素脱除
Summary
我们描述了一个平台，它利用异源性抗生素耐药大肠杆菌库来消除抗生素。细菌或真菌产生的抗生素的特性可以通过表达其各自抗药性基因的大肠杆菌的生长来推断出来。该平台经济高效且具有时间效率。
Abstract
从天然产物提取物中寻找新的抗生素的主要挑战之一是重新发现常见化合物。为了应对这一挑战，对感兴趣的样品进行脱体，即识别已知化合物的过程。脱体方法，如分析分离，然后是质谱法，既费时又耗费资源。为了改进脱复制过程，我们开发了抗生素耐药性平台（ARP）。ARP 是一个包含大约 100 个抗生素耐药性基因的库，这些基因已单独克隆到大肠杆菌中。这种菌株收集有许多应用，包括一种经济高效且方便的抗生素脱压方法。这个过程涉及在含有固体介质的矩形培养皿表面发酵产生抗生素的微生物，从而允许二次代谢物通过培养基分泌和扩散。经过6天的发酵期，微生物生物量被去除，并在培养皿中加入薄琼脂覆盖层，以形成光滑的表面，使大肠杆菌指标菌株生长。然后，我们收集的 ARP 菌株固定在含抗生素的培养皿表面。该板是下一个孵育过夜，以允许大肠杆菌生长在覆盖的表面。只有含有对特定抗生素（或类）的耐药性的菌株才能在此表面上生长，从而能够快速识别所生产的化合物。该方法已成功用于识别已知抗生素的生产商，并作为识别产生新化合物的人的手段。
Introduction
自1928年发现青霉素以来，来自环境微生物的天然产物已被证明是抗菌化合物1的丰富来源。大约80%的天然产品抗生素来自链霉菌属和其他活动性霉菌的细菌，而其余20%是由真菌物种1产生的。临床中使用的一些最常见的抗生素支架，如β-乳糖、四环素、里法霉素和氨基糖苷，最初是从微生物2中分离出来的。然而，由于耐多药细菌（MDR）的上升，我们目前的抗生素小组在治疗3、4方面效果已经降低。这些病原体包括”ESKAPE”病原体（即，耐万古霉素肠球菌和β-乳酸葡萄球菌、肺炎克列比氏菌、假单抗、阿辛托杆菌和肠杆菌），这是一些主要公共卫生当局认为与最高风险相关的细菌的子集，如世界卫生组织3、4、5。这些MDR病原体的出现和全球传播导致对新型抗生素的不断需求3，4，5。令人遗憾的是，过去二十年已表明，从微生物来源发现新型抗生素越来越困难。目前的药物发现方法包括生物活性化合物的高通量筛选，包括天然产物提取物库，允许在给定时间测试数千种提取物2。然而，一旦检测到抗菌活性，下一步是分析粗提取物的含量，以确定活性成分，并消除那些含有已知或冗余化合物7，8。这个过程，称为去复制，对于预防和/或显著减少重新发现已知抗生素7，9的时间至关重要。虽然天然产品药物发现的必要步骤，脱复制是出了名的费力和资源密集型10。
自从Beutler等人首次发明”去复制”一词以来，已经做出了广泛的努力，为快速识别已知的抗生素11、12制定创新战略。今天，用于脱模最常见的工具包括分析色谱系统，如高性能液相色谱、质谱法和基于核磁共振的检测方法11、13。不幸的是，这些方法中的每一个都需要使用昂贵的分析设备和复杂的数据解释。
为了开发一种无需专用设备即可快速执行的去复制方法，我们建立了抗生素耐药性平台（ARP）10。ARP 可用于发现抗生素佐剂、分析新的抗生素化合物对抗已知的耐药性机制，以及从动效细菌和其他微生物中提取的已知抗生素的去复制。在这里，我们专注于它在抗生素脱位中的应用。ARP利用一个各源性大肠杆菌菌株库，表达个体抗药性基因，这些基因对最常见的重新发现的抗生素14、15有效。当大肠杆菌库在二次代谢物产生生物的存在下生长时，该化合物的特性可以通过表达其相关抗性基因10的大肠杆菌菌株的生长来推导。当ARP首次被报告时，该库由>40个基因组成，对16种抗生素类具有抗药性。原始的去复制模板被设计为包含每个抗生素类的抗药性基因子集，以在脱模过程中提供有关抗生素亚类的信息。今天，ARP由>90个基因组成，这些基因对18种抗生素具有抗药性。利用我们广泛的抗药性基因集合，开发了一个二次脱体模板，被称为最小抗生素耐药性平台（MARP）。创建此模板是为了消除基因冗余，并简单地提供有关一般抗生素类别的信息，该类别与复制代谢物相关。此外，MARP模板具有野生型和大肠杆菌BW25113（大肠杆菌BW25113+巴B+tolC）的超渗透/排泄缺陷菌株，与ARP的原始化身相比，后者仅利用超渗透应变。这种独特的方面在脱体过程中产生额外的表型，表明化合物能够穿过革兰氏阴性细菌的外膜。在这里，我们描述了在取消ARP和/或MARP的复制时应遵循的稳健协议，重点介绍了要遵循的最关键步骤，并讨论了各种可能的结果。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述方案可应用于新型抗菌化合物和佐剂的发现，这些化合物和佐剂可与现有抗生素结合使用，以挽救其活性。该平台利用抗药性机制的高基质特异性及其共性抗生素，在粗天然产物提取物中分解化合物。尽管准备脱粒板所需的时间很长（±2周），但脱粒复制过程本身是在一个过夜的潜伏期后完成的，与分离和表征所需的时间相比，这非常迅速。来自原油提取物的化合物。此外，无需昂贵或高度?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
赖特实验室关于ARP/MARP的研究得到了安大略省研究基金和加拿大卫生研究所赠款（FRN-148463）的支持。我们感谢周苏默协助扩大和组织ARP图书馆。
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
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