Antibiotica-Dereplicatie met behulp van het antibioticumresistentie platform
Summary
We beschrijven een platform dat gebruik maakt van een bibliotheek van isogene antibiotica resistente Escherichia coli voor de dereplicatie van antibiotica. De identiteit van een antibioticum dat door bacteriën of schimmels wordt geproduceerd, kan worden afgeleid uit de groei van E. coli , waarin het respectieve resistentie-gen wordt uitgesproken. Dit platform is economisch effectief en tijd efficiënt.
Abstract
Een van de belangrijkste uitdagingen bij het zoeken naar nieuwe antibiotica uit natuurlijke product extracten is de herontdekking van gemeenschappelijke verbindingen. Om deze uitdaging aan te pakken, wordt dereplication, dat is het proces van het identificeren van bekende verbindingen, uitgevoerd op monsters van belang. Methoden voor dereplicatie zoals analytische scheiding gevolgd door massaspectrometrie zijn tijdrovend en resource-intensieve. Om het dereplicatie proces te verbeteren hebben we het antibioticum Resistance platform (ARP) ontwikkeld. De ARP is een bibliotheek met ongeveer 100 antibioticaresistentiegenen die individueel zijn gekloond tot Escherichia coli. Deze stam collectie heeft vele toepassingen, met inbegrip van een kosteneffectieve en facile methode voor antibioticum dereplication. Het proces omvat de fermentatie van antibiotica-producerende microben op het oppervlak van rechthoekige Petri schalen die een vast medium bevatten, waardoor de afscheiding en verspreiding van secundaire metabolieten via het medium mogelijk wordt. Na een fermentatie periode van 6 dagen wordt de microbiële biomassa verwijderd en wordt een dunne agar-overlay aan de Petri schaal toegevoegd om een glad oppervlak te creëren en de groei van de E. coli -indicator stammen mogelijk te maken. Onze verzameling van ARP-stammen wordt vervolgens vastgemaakt aan het oppervlak van de antibioticum bevattende Petri schaal. De plaat wordt vervolgens ‘s nachts geïnineerd om E. coli groei op het oppervlak van de overlay mogelijk te maken. Alleen stammen die resistentie tegen een specifiek antibioticum (of klasse) bevatten, groeien op dit oppervlak waardoor de geproduceerde stof snel geïdentificeerd wordt. Deze methode is met succes gebruikt voor de identificatie van producenten van bekende antibiotica en als middel om te identificeren die nieuwe verbindingen produceren.
Introduction
Sinds de ontdekking van penicillaire in 1928, natuurlijke producten afgeleid van milieu-micro-organismen hebben bewezen een rijke bron van antimicrobiële verbindingen1. Ongeveer 80% van de antibiotica van het natuurlijke product zijn afgeleid van bacteriën van het geslacht Streptomyces en andere Actinomyceten, terwijl de resterende 20% wordt geproduceerd door schimmelsoorten1. Enkele van de meest voorkomende antibiotica-steigers die in de kliniek worden gebruikt, zoals de β-lactams, tetracyclines, rifamycinen en aminoglycosiden, werden oorspronkelijk geïsoleerd van microben2. Vanwege de opkomst van multiresistente (MDR) bacteriën is ons huidige panel van antibiotica echter minder effectief geworden in de behandeling van3,4. Deze omvatten de “eskape” pathogenen (d.w.z. vancomycine-resistente enterokokken en β-lactam-resistente Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, en Enterobacter SP.), een subset van bacteriën die geacht worden geassocieerd te worden met het hoogste risico door een aantal grote volksgezondheidsinstanties zoals de Wereldgezondheidsorganisatie3,4,5. De opkomst en wereldwijde verspreiding van deze MDR-pathogenen resulteert in een constante behoefte aan nieuwe antibiotica3,4,5. Helaas hebben de voorbije twintig jaar aangetoond dat de ontdekking van nieuwe antibiotica uit microbiële bronnen steeds moeilijker wordt6. Huidige benaderingen van Drug Discovery omvatten de hoge doorvoer screening van bioactieve verbindingen, met inbegrip van natuurlijke product extract Bibliotheken, waardoor duizenden extracten worden getest op een gegeven moment2. Echter, zodra antimicrobiële activiteit wordt gedetecteerd, de volgende stap is het analyseren van de inhoud van het ruwe extract om de actieve component te identificeren en elimineren die met bekende of redundante verbindingen7,8. Dit proces, “dereplication” genoemd, is van vitaal belang om de tijd die aan de herontdekking van bekende antibiotica7,9wordt besteed, te voorkomen en/of aanzienlijk te verkorten. Hoewel een noodzakelijke stap in het opsporen van natuurlijke geneesmiddelen, dereplication is berukker bewerkelijk en resource-intensieve10.
Sinds Beutler et al. eerst bedacht de term “dereplication”, uitgebreide inspanningen zijn gedaan om innovatieve strategieën voor de snelle identificatie van bekende antibiotica te ontwikkelen11,12. Vandaag de dag zijn de meest gebruikte instrumenten voor dereplicatie analytische chromatografische systemen zoals krachtige vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en op nucleaire magnetische resonantie gebaseerde detectiemethoden11,13. Helaas vereist elk van deze methoden het gebruik van dure analytische apparatuur en geavanceerde gegevens interpretatie.
In een poging om een dereplication methode te ontwikkelen die snel kan worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur, hebben we het antibioticum Resistance platform (ARP)10opgericht. De ARP kan worden gebruikt voor de ontdekking van antibiotica-adjuvantia, de profilering van nieuwe antibiotica verbindingen tegen bekende resistentiemechanismen en de dereplicatie van bekende antibiotica in extracten afkomstig van actinobacteriën en andere microben. Hier, we richten ons op de toepassing ervan in antibioticum dereplication. De ARP gebruikt een bibliotheek van isogene Escherichia coli stammen die individuele resistentiegenen uitdrukken die effectief zijn tegen de meest in het algemeen opnieuw ontdekte antibiotica14,15. Wanneer de E. coli bibliotheek wordt geteeld in aanwezigheid van een secundaire metaboliet-producerende organisme, de identiteit van de compound kan worden afgeleid door de groei van e. coli stammen die de bijbehorende weerstand gen10uitdrukken. Toen de ARP voor het eerst werd gerapporteerd, bestond de bibliotheek uit > 40 genen die resistentie tegen 16 antibiotica klassen verlenen. De oorspronkelijke dereplication template is ontworpen om een subset van resistentiegenen per antibiotica klasse te omvatten om informatie te verstrekken over antibiotica subklasse tijdens het dereplication proces. Tegenwoordig bestaat de ARP uit > 90 genen die resistentie verlenen aan 18 antibiotica klassen. Met behulp van onze uitgebreide collectie van resistentiegenen is een secundair dereplication template ontwikkeld en staat bekend als het minimale antibiotica Resistance platform (MARP). Deze sjabloon is gemaakt om te elimineren van Gene redundantie en eenvoudig informatie te verstrekken over de algemene antibiotica klasse die een dereplicated metaboliet is gerelateerd aan. Daarnaast bezit het MARP-template zowel wild type als een hyperpermeabele/effluxdeficiënte stam van e. coli BW25113 (E. coli BW25113 δBAMBδtolc), vergeleken met de oorspronkelijke incarnatie van de ARP, die alleen maakt gebruik van de hyperpermeabele stam. Dit unieke aspect creëert extra fenotypes tijdens dereplicatie, wat duidt op een verbindingen vermogen om het buitenste membraan van gram-negatieve bacteriën over te steken. Hier beschrijven we een robuust protocol dat moet worden gevolgd bij het derepliceren met ofwel de ARP en/of MARP, Markeer de meest kritieke stappen die moeten worden gevolgd, en bespreek de verschillende mogelijke uitkomsten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierboven beschreven protocol kan worden toegepast op zowel de ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen als adjuvantia die kunnen worden gebruikt in combinatie met bestaande antibiotica om hun activiteit te redden. Het platform maakt gebruik van de hoge substraat specificiteit van resistentiemechanismen en hun verwant antibiotica, tot dereplicate verbindingen binnen ruwe natuurlijke product extracten. Hoewel de tijd die nodig is voor de voorbereiding van de dereplicatie platen lang is (~ 2 weken), is het derepli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek in het Wright Lab met betrekking tot de ARP/MARP werd ondersteund door het Ontario Research Fund en Canadian Institutes of Health Research Grant (FRN-148463). We willen Sommer Chou graag erkennen voor het ondersteunen van de uitbreiding en organisatie van de ARP-bibliotheek.
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
