Summary

Antibiotika-Dereplikation mit der Antibiotikaresistenzplattform

Published: October 17, 2019
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Summary

Wir beschreiben eine Plattform, die eine Bibliothek von isogenen antibiotikaresistenten Escherichia coli für die Dereplikation von Antibiotika nutzt. Die Identität eines von Bakterien oder Pilzen produzierten Antibiotikums kann durch das Wachstum von E. coli abgeleitet werden, das sein jeweiliges Resistenzgen ausdrückt. Diese Plattform ist wirtschaftlich effektiv und zeiteffizient.

Abstract

Eine der größten Herausforderungen bei der Suche nach neuen Antibiotika aus Naturproduktextrakten ist die Wiederentdeckung gängiger Verbindungen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird die Dereplikation, d. h. der Prozess der Identifizierung bekannter Verbindungen, an Voninteresse steilenProben durchgeführt. Methoden zur Dereplikation wie die analytische Trennung gefolgt von der Massenspektrometrie sind zeitaufwändig und ressourcenintensiv. Um den Dereplikationsprozess zu verbessern, haben wir die Antibiotikaresistenzplattform (ARP) entwickelt. Die ARP ist eine Bibliothek von etwa 100 Antibiotikaresistenzgenen, die einzeln in Escherichia coli geklont wurden. Diese Stammsammlung hat viele Anwendungen, einschließlich einer kostengünstigen und einfachen Methode für die Dereplikation von Antibiotika. Der Prozess beinhaltet die Fermentation von antibiotikaproduzierenden Mikroben auf der Oberfläche von rechteckigen Petrischalen, die festes Medium enthalten, wodurch die Sekretion und Diffusion von sekundären Metaboliten durch das Medium ermöglicht wird. Nach einer 6-tägigen Fermentationsphase wird die mikrobielle Biomasse entfernt und der Petrischale wird ein dünnes Agar-Overlay hinzugefügt, um eine glatte Oberfläche zu schaffen und das Wachstum der E. coli-Indikatorstämme zu ermöglichen. Unsere Sammlung von ARP-Stämmen wird dann auf die Oberfläche der antibiotikahaltigen Petrischale gepinnt. Die Platte wird als nächstes über Nacht inkubiert, um E. coli-Wachstum auf der Oberfläche der Überlagerung zu ermöglichen. Nur Stämme, die Resistenzen gegen ein bestimmtes Antibiotikum (oder eine bestimmte Klasse) enthalten, wachsen auf dieser Oberfläche, was eine schnelle Identifizierung der produzierten Verbindung ermöglicht. Diese Methode wurde erfolgreich zur Identifizierung von Herstellern bekannter Antibiotika und als Mittel zur Identifizierung der Hersteller neuartiger Verbindungen eingesetzt.

Introduction

Seit der Entdeckung von Penicillin im Jahr 1928 haben sich natürliche Produkte aus Umweltmikroorganismen als reiche Quelle antimikrobieller Verbindungen erwiesen1. Ungefähr 80% der Natürlichen Produkte Antibiotika werden von Bakterien der Gattung Streptomyces und anderen Actinomycetes abgeleitet, während die restlichen 20% von Pilzarten produziert werden1. Einige der häufigsten Antibiotika-Gerüste, die in der Klinik verwendet werden, wie die Lactams, Tetracycline, Rifamycine und Aminoglykoside, wurden ursprünglich aus Mikroben isoliert2. Aufgrund des Anstiegs von multiresistenten (MDR) Bakterien ist unser aktuelles Antibiotika-Panel in der Behandlung3,4weniger wirksam geworden. Dazu gehören die “ESKAPE”-Erreger (d.h. vancomycinresistente Enterokokken und Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, und Enterobacter sp.), die eine Teilmenge von Bakterien sind, die von einer Reihe wichtiger Gesundheitsbehörden wie der Weltgesundheitsorganisation3,4,5als mit dem höchsten Risiko assoziiert angesehen werden. Das Aufkommen und die weltweite Ausbreitung dieser MDR-Erreger führen zu einem konstanten Bedarf an neuartigen Antibiotika3,4,5. Bedauerlicherweise haben die letzten zwei Jahrzehnte gezeigt, dass die Entdeckung neuartiger Antibiotika aus mikrobiellen Quellen immer schwieriger wird6. Aktuelle Ansätze zur Arzneimittelentdeckung umfassen das Hochdurchsatz-Screening von bioaktiven Verbindungen, einschließlich Natürlicherextraktbibliotheken, so dass Tausende von Extrakten zu einem bestimmten Zeitpunkt getestet werden können2. Sobald jedoch antimikrobielle Aktivität erkannt wird, besteht der nächste Schritt darin, den Inhalt des Rohextrakts zu analysieren, um die aktive Komponente zu identifizieren und diejenigen zu beseitigen, die bekannte oder redundante Verbindungen enthalten7,8. Dieser Prozess, der als Dereplikation bezeichnet wird, ist von entscheidender Bedeutung, um die Zeit, die für die Wiederentdeckung bekannter Antibiotika aufgewendet wird, zu verhindern und/oder erheblich zu reduzieren7,9. Obwohl ein notwendiger Schritt in der Entdeckung von Naturprodukten, Ist die Dereplikation notorisch mühsam und ressourcenintensiv10.

Seit Beutler et al. den Begriff “Dereplikation” erstmals geprägt haben, wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um innovative Strategien zur schnellen Identifizierung bekannter Antibiotika zu entwickeln11,12. Heute sind die häufigsten Werkzeuge für die Dereplikation analytische chromatographische Systeme wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Kernspinresonanz-basierte Detektionsmethoden11,13. Leider erfordert jede dieser Methoden den Einsatz teurer Analysegeräte und ausgeklügelter Dateninterpretation.

In dem Versuch, eine Dereplikationsmethode zu entwickeln, die schnell ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden kann, haben wir die Antibiotikaresistenzplattform (ARP)10eingerichtet. Die ARP kann für die Entdeckung von Antibiotika-Adjuvantien, die Profilierung neuer Antibiotika-Verbindungen gegen bekannte Resistenzmechanismen und die Dereplikation bekannter Antibiotika in Extrakten aus Aktinobakterien und anderen Mikroben verwendet werden. Hier konzentrieren wir uns auf seine Anwendung bei der Dereplikation von Antibiotika. Die ARP nutzt eine Bibliothek von isogenen Escherichia coli-Stämmen, die individuelle Resistenzgene exdrücken, die gegen die am häufigsten wiederentdeckten Antibiotika14,15wirksam sind. Wenn die E. coli-Bibliothek in Gegenwart eines sekundären Metaboliten produzierenden Organismus angebaut wird, kann die Identität der Verbindung durch das Wachstum von E. coli-Stämmen abgeleitet werden, die das zugehörige Resistenzgen10ausdrücken. Als die ARP zum ersten Mal gemeldet wurde, bestand die Bibliothek aus >40 Genen, die eine Resistenz für 16 Antibiotikaklassen verliehen. Die ursprüngliche Dereplikationsvorlage wurde entwickelt, um eine Teilmenge von Resistenzgenen pro Antibiotikaklasse zu umfassen, um Informationen über die Unterklasse von Antibiotika während des Dereplikationsprozesses bereitzustellen. Heute besteht die ARP aus >90 Genen, die 18 Antibiotikaklassen Resistenzen verleihen. Mit unserer umfangreichen Sammlung von Resistenzgenen wurde eine sekundäre Dereplikationsvorlage entwickelt, die als minimale Antibiotikaresistenzplattform (MARP) bekannt ist. Diese Vorlage wurde erstellt, um Genredundanz zu beseitigen und einfach Informationen über die allgemeine Antibiotikaklasse bereitzustellen, mit der ein dereplizierter Metabolit verwandt ist. Darüber hinaus besitzt die MARP-Vorlage sowohl Wildtyp als auch einen hyperpermeablen/efflux-defizienten Stamm von E. coli BW25113 (E. coli BW25113 nutzt die hyperpermeable Sorte. Dieser einzigartige Aspekt erzeugt zusätzliche Phänotypen während der Dereplikation, was auf eine Verbindungen Fähigkeit, die äußere Membran von Gram-negativen Bakterien zu überqueren. Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll, das bei der Dereplikation mit dem ARP und/oder MARP zu befolgen ist, heben die wichtigsten Schritte hervor, die befolgt werden müssen, und besprechen die verschiedenen möglichen Ergebnisse.

Protocol

1. Herstellung von E. coli Bibliothek Glycerin Bestände (von Agar Slants) Streichen Sie die ARP/MARP E. coli-Stämme aus Lysogeny-Brühe (LB) Agar schräg auf Petrischalen, die LB-Agar und den entsprechenden wählbaren Marker enthalten (Tabelle 1). Bereiten Sie Kulturen für jede der E. coli-Stämme vor, indem Sie 3 ml LB impfen, die den entsprechenden wählbaren Marker mit einer einzigen Kolonie enthalten. Über Nacht bei 37 °C mit Belüftung (250 Rpm) wa…

Representative Results

Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt, als eine Sammlung von antibiotikaproduzierenden Stämmen von Interesse mit dem ARP und/oder MARP derepliziert wurde. Ein Diagramm des ARP/MARP-Dereplikationsworkflows ist in Abbildung 1dargestellt, und Bibliotheksplattenkarten sind in Ergänzenden Abbildung1 und Ergänzenden Abbildung 2dargestellt. Abbildung 2 zeigt ein positives Dereplikationsergebnis, bei dem…

Discussion

Das oben beschriebene Protokoll kann sowohl auf die Entdeckung neuartiger antimikrobieller Verbindungen als auch auf Hilfsstoffe angewendet werden, die in Verbindung mit bestehenden Antibiotika zur Rettung ihrer Aktivität verwendet werden können. Die Plattform nutzt die hohe Substratspezifität von Resistenzmechanismen und deren Kognatenantibiotika, um Verbindungen in rohen Naturproduktextrakten zu dereplizieren. Obwohl die Fürdieherzustellenszeit benötigte Zeit lang ist (ca. 2 Wochen), ist der Dereplikationsprozess …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Forschung im Wright-Labor im Bereich aRP/MARP wurde vom Ontario Research Fund und dem Canadian Institutes of Health Research Grant (FRN-148463) unterstützt. Wir möchten Sommer Chou für seine Unterstützung bei der Erweiterung und Organisation der ARP-Bibliothek danken.

Materials

Agar Bio Shop AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage Sigma-Aldrich Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt Bio Shop AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton Dickinson 212322
BBL Phytone Peptone (Soytone) Becton Dickinson 211906
Calcium Carbonate Bio Shop CAR303.500
Casamino acid Bio Basic 3060
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour Sarstedt 72.379.992
D-glucose Bio Shop GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm Fisher Scientific 14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous Commercial Alcohols P016EAAN
Glass Beads, Solid Fisher Scientific 11-312C
Glycerol Bio Shop GLY001.4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Instant sealing sterilization pouch Fisher Scientific 01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich F7002-250G
Kanamycin Sulfate Bio Shop KAN201.50
LB Broth Lennox Bio Shop LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size Millipore-Sigma HAWP00010 10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base Sarstedt 82.1582.001
New Brunswick Innova 44 Eppendorf M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Fisher Scientific 264728 with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams Sarstedt 82.1473.001
Pinning tools ETH Zurich Custom order
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potato starch Bulk Barn 279
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium Nitrate Fisher Scientific S343-500
Wood Applicators Dukal Corporation 9000
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2

References

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Cite This Article
Zubyk, H. L., Cox, G., Wright, G. D. Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform. J. Vis. Exp. (152), e60536, doi:10.3791/60536 (2019).

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