우리는 항생제의 복제를 위한 이소제닉 항생제 저항하는 대장균의 도서관을 이용하는 플랫폼을 기술합니다. 박테리아 또는 곰팡이에 의해 생성된 항생제의 정체성은 각각의 내성 유전자를 발현하는 대장균의 성장에 의해 추론될 수 있다. 이 플랫폼은 경제적으로 효과적이고 시간 효율적입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
천연 물 추출물에서 새로운 항생제에 대 한 검색에 주요 과제 중 하나는 일반적인 화합물의 재발견. 이 문제를 해결하기 위해 알려진 화합물을 식별하는 프로세스인 복제 해제가 관심 있는 샘플에서 수행됩니다. 분석 분리와 질량 분석과 같은 복제 를 위한 방법은 시간이 많이 걸리고 리소스집약적입니다. 복제 를 개선하기 위해 항생제 내성 플랫폼 (ARP)을 개발했습니다. ARP는 대장균에 개별적으로 복제된 약 100개의 항생제 내성 유전자의 라이브러리입니다. 이 균주 수집은 항생제 복제를 위한 비용 효과적이고 허구적인 방법을 포함하여 많은 응용을 가지고 있습니다. 이 과정은 고체 배지를 포함하는 직사각형 페트리 접시의 표면에 항생제 생산 미생물의 발효를 수반하여 매체를 통해 이차 대사 산물의 분비 및 확산을 허용합니다. 6일 발효 기간 이후에 미생물 바이오매스를 제거하고, 얇은 한천 오버레이를 페트리 접시에 첨가하여 매끄러운 표면을 만들고 대장균 표시기 균주의 성장을 가능하게 한다. ARP 균주의 우리의 컬렉션은 다음 항생제 함유 페트리 접시의 표면에 고정된다. 플레이트는 오버레이의 표면에 대장균 성장을 허용하기 위해 밤새 배양된다. 특정 항생제 (또는 클래스)에 대한 내성을 포함하는 균주만이 이 표면에서 성장하여 생성된 화합물을 신속하게 식별할 수 있습니다. 이 방법은 알려진 항생제의 생산자의 식별및 새로운 화합물을 생산하는 사람들을 식별하는 수단으로 성공적으로 사용되었습니다.
서론
1928년 페니실린이 발견된 이래, 환경 미생물에서 유래한 천연물은 항균 화합물의 풍부한 공급원인 것으로 입증되었다1. 천연물 항생제의 약 80%는 연쇄상 구균 과 다른 액티노마이세테 속의 박테리아에서 유래하며, 나머지 20%는 곰팡이 종1에의해 생성됩니다. β-락탐, 테트라사이클린, 리파마이신 및 아미노글리코시드와 같은 클리닉에서 사용되는 가장 일반적인 항생제 스캐폴드 중 일부는 원래 미생물2로부터분리되었다. 그러나, 다중 약 저항하는 (MDR) 박테리아의 상승 때문에, 항생제의 우리의 현재 패널은 처리에 있는 보다 적게 효과적이되었습니다3,4. 이들은 "ESKAPE" 병원체 (즉, 반코마이신 내성 장구균 및 β-락탐 내성 황색포도상구균, Klebsiella pneumoniae, 슈도모나스 aeruginosa, 아신토박터 보만니,및 Enterobacter sp.), 이는 세계보건기구(WHO)3,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 대장균 도서관 글리세롤 주식 준비 (한천 슬랜트에서)
- ARP/MARP 대장균 균주를 리소제니 국물(LB)에서 LB 한천과 적절한 선택 가능한 마커를 함유하는 페트리 접시에 비스듬히 기울게한다(표 1).
- 단일 콜로니와 함께 적절한 선택 가능한 마커를 함유하는 LB의 3 mL을 접종하여 각 대장균 균주에 대한 배양을 준비한다. 폭기 (250 rpm)로 37 °C에서 하룻밤 성장.
- 배양 800 μL과 멸균 80% 글리세롤 200 μL을 1.8 mL 극저온으로 결합합니다. 튜브를 3-4회 반전시켜 혼합하고 -80°C에서 보관합니다.
2. ARP / MARP 냉동 재고 라이브러리 플레이트 준비
- 섹션 1에서 제조된 글리세롤 스톡에서 LB 한천과 적절한 선택 가능한 마커를 포함하는 새로운 페트리 접시 세트에 ARP/MARP 균주를 줄무늬. 37 °C에서 하룻밤 성장.
- 무균 기술을 사용하여, 양이온의 피펫 500 μL은 멸균 저수지로부터 뮬러 힌튼 국물(MHB)을 멸균 된 96 개의 깊은 웰 플레이트의 각 우물로 조정하였다.
- 2.1단계에서 제조된 플레이트를 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
다음 결과는 관심의 항생제 생산 긴장의 집합이 ARP 및/또는 MARP를 사용하여 복제될 때 장악되었습니다.
ARP/MARP 복제 워크플로의 다이어그램은 그림 1에나와 있으며 라이브러리 플레이트 맵은 추가 그림 1 및 보충 그림 2에표시됩니다. 도 2는 환경 추출물 WAC 8921이 클로람페니콜 생산자로 확인되는 것을 통해 양성 복제 결과를 나타낸다. 도 3은 ARP 성장의 부족을 전적으로 나타내며, 이는 ARP/MARP 라이브러리 플레이트에서 고려되지 않은 알려지지 않은 항생제 또는 덜 일반적으로 발견되는 항생제의 존재를 나타낸다. 도 4는 야생형 대장균 BW25113 및 과다 투과성 및 유.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
전술한 프로토콜은 그들의 활성을 구출하기 위해 기존 항생제와 함께 사용될 수 있는 신규한 항균 화합물 및 보조제의 발견 모두에 적용될 수 있다. 이 플랫폼은 내성 메커니즘과 동종 항생제의 높은 기질 특이성을 활용하여 원유 천연 물추출물 내에서 화합물을 복제합니다. 복제 플레이트를 준비하는 데 필요한 시간이 길지만(~2주), 복제 프로세스 자체는 단일 하룻밤 잠복기 후에 완료되며, 이는 분리및 특성화하는 데 걸리는 시간과 비교하여 빠를 수 있습니다. 원유 추출물에서 화합물. 또한 고가이거나 고도로 전문화된 장비가 필요하지 않으며, 이 플랫폼에 접근가능하고 비용 효율적입니다.
이 플랫폼의 또 다른 주요 이점은 유연성입니다. ARP는 더 많은 항생제 클래스를 포괄하는 저항 유전자를 포함하도록 확장될 수 있다. 이것은 새로운 저항 효소의 출현을 위한 문헌을 감시하고 대장균 도서관에 유전자를 추가하는 기본적인 분자 복제 기술을 사용하여 달성됩니다. 또한 복제 해제 템플릿은.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
ARP/MARP에 관련 된 라이트 실험실에서 연구 온타리오 연구 기금 및 건강 연구 보조금의 캐나다 연구소에 의해 지원 되었다 (FRN-148463). 우리는 ARP 라이브러리의 확장 및 구성을 지원 한 Sommer Chou를 인정하고 싶습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| 암피실린 나트륨 염 | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (양이온 조절) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| 탄산칼슘 | Bio Shop | CAR303.500 | |
| 카사미노 산 | Bio Basic | 3060 | |
| 면 팁 애플리케이터 | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| 일회용 배양 튜브, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| 에틸 알코올 무수 | 상업용 알코올 | P016EAAN | |
| 유리 구슬, 고체 | Fisher Scientific | 11-312C | |
| 글리세롤 | 바이오 샵 | GLY001.4 | |
| 염산 | Fisher Scientific | A144-212 | |
| 인스턴트 밀봉 살균 파우치 | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| 철 (II) 황산염 헵타하이드레이트 | 시그마-알드리치 | F7002-250G | |
| 카나마이신 설페이 | 바이오 샵 | KAN201.50 | |
| LB 육수 레녹스 | 바이오 샵 | LBL405.500 | |
| 마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore 멤브레인 필터, 0.45 &마이크로; m 기공 크기 | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT 롤, 친수성, 흰색, 일반 |
| Microtest Plate 96 well, 라운드 베이스 | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 뚜껑 포함, 멸균, 미처리 | |
| 페트리 접시 92 mm x 16 mm 캠 | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| 피닝 도구 | ETH Zurich-Custom | ||
| order Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 감자 전분 | 벌크 헛간 | 279 | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| 질산나트륨 | Fisher Scientific | S343-500 | |
| 목재 애플리케이터 | Dukal Corporation | 9000 | |
| 효모 추출물 | Fisher Scientific | BP1422-2 |
참고문헌
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening f....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
