Déplication d'antibiotiques à l'aide de la plate-forme de résistance aux antibiotiques
Summary
Nous décrivons une plate-forme qui utilise une bibliothèque d’Escherichia coli résistant aux antibiotiques isogéniques pour la déplication des antibiotiques. L’identité d’un antibiotique produit par des bactéries ou des champignons peut être déduite par la croissance de E. coli exprimant son gène de résistance respectif. Cette plate-forme est économiquement efficace et efficace en temps.
Abstract
L’un des principaux défis dans la recherche de nouveaux antibiotiques à partir d’extraits de produits naturels est la redécouverte de composés communs. Pour relever ce défi, la déplication, qui consiste à identifier les composés connus, est effectuée sur des échantillons d’intérêt. Les méthodes de déplication telles que la séparation analytique suivie de la spectrométrie de masse prennent beaucoup de temps et consomment beaucoup de ressources. Pour améliorer le processus de déplication, nous avons développé la plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP). L’ARP est une bibliothèque d’environ 100 gènes de résistance aux antibiotiques qui ont été individuellement clonés en Escherichia coli. Cette collection de souches a de nombreuses applications, y compris une méthode rentable et facile pour la déplication des antibiotiques. Le processus implique la fermentation de microbes produisant des antibiotiques à la surface des plats rectangulaires Petri contenant milieu solide, permettant ainsi la sécrétion et la diffusion de métabolites secondaires à travers le milieu. Après une période de fermentation de 6 jours, la biomasse microbienne est enlevée, et une mince agar-overlay est ajoutée au plat Petri pour créer une surface lisse et permettre la croissance des souches de l’indicateur E. coli. Notre collection de souches ARP est ensuite épinglée sur la surface du plat Petri contenant des antibiotiques. La plaque est ensuite incubée pendant la nuit pour permettre la croissance d’E. coli à la surface de la perceuse. Seules les souches contenant une résistance à un antibiotique spécifique (ou classe) se développent sur cette surface permettant l’identification rapide du composé produit. Cette méthode a été utilisée avec succès pour l’identification des producteurs d’antibiotiques connus et comme un moyen d’identifier ceux qui produisent de nouveaux composés.
Introduction
Depuis la découverte de la pénicilline en 1928, les produits naturels dérivés de micro-organismes environnementaux se sont avérés être une riche source de composés antimicrobiens1. Environ 80% des antibiotiques de produits naturels sont dérivés de bactéries du genre Streptomyces et d’autres actinomycéres, tandis que les 20% restants sont produits par des espèces fongiques1. Certains des échafaudages antibiotiques les plus courants utilisés dans la clinique, tels que les lactams, les tétracyclines, les rifamycines et les aminoglycosides, ont été isolés à l’origine à partir de microbes2. Cependant, en raison de l’augmentation des bactéries multirésistantes (MDR), notre panel actuel d’antibiotiques est devenu moins efficace dans le traitement3,4. Il s’agit notamment des agents pathogènes “ESKAPE” (c.-à-d., entérocoques résistants à la vancomycine et Staphylococcus aureusrésistant au lactam , Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, et Enterobacter sp.), qui sont un sous-ensemble de bactéries considérées comme associées au risque le plus élevé par un certain nombre de grandes autorités de santé publique telles que l’Organisation mondiale de la Santé3,4,5. L’émergence et la propagation mondiale de ces agents pathogènes MDR entraîne un besoin constant d’antibiotiques nouveaux3,4,5. Malheureusement, les deux dernières décennies ont démontré que la découverte de nouveaux antibiotiques provenant de sources microbiennes est de plus en plus difficile6. Les approches actuelles de la découverte de médicaments comprennent le dépistage à haut débit des composés bioactifs, y compris les bibliothèques d’extraits de produits naturels, permettant de tester des milliers d’extraits à un moment donné2. Cependant, une fois que l’activité antimicrobienne est détectée, l’étape suivante consiste à analyser le contenu de l’extrait brut afin d’identifier la composante active et d’éliminer ceux qui contiennent des composés connus ou redondants7,8. Ce processus, appelé déplication, est essentiel pour prévenir et/ou réduire considérablement le temps consacré à la redécouverte d’antibiotiques connus7,9. Bien qu’une étape nécessaire dans la découverte de médicaments de produits naturels, la déplication est notoirement laborieuse et gourmande en ressources10.
Depuis que Beutler et coll. ont inventé le terme « déplication », des efforts considérables ont été déployés pour élaborer des stratégies novatrices pour l’identification rapide des antibiotiques connus11,12. Aujourd’hui, les outils les plus communs utilisés pour la déplication incluent les systèmes chromatographiques analytiques tels que la chromatographie liquide de haute performance, la spectrométrie de masse, et les méthodes de détection par résonance magnétique nucléaire11,13. Malheureusement, chacune de ces méthodes nécessite l’utilisation d’équipements d’analyse coûteux et d’une interprétation sophistiquée des données.
Dans une tentative de développer une méthode de déplication qui peut être rapidement effectuée sans équipement spécialisé, nous avons établi la plate-forme de résistance aux antibiotiques (ARP)10. L’ARP peut être utilisé pour la découverte d’adjuvants antibiotiques, le profilage de nouveaux composés antibiotiques contre les mécanismes de résistance connus, et la déplication d’antibiotiques connus dans des extraits dérivés d’actinobactéries et d’autres microbes. Ici, nous nous concentrons sur son application dans la déplication d’antibiotiques. L’ARP utilise une bibliothèque de souches isogènes Escherichia coli exprimant des gènes de résistance individuels qui sont efficaces contre les antibiotiques les plus couramment redécouverts14,15. Lorsque la bibliothèque E. coli est cultivée en présence d’un organisme secondaire producteur de métabolites, l’identité du composé peut être déduite par la croissance des souches d’E. coli qui expriment son gène de résistance associé10. Lorsque l’ARP a été signalé pour la première fois, la bibliothèque se composait de gènes de 40 livres conférant une résistance à 16 classes d’antibiotiques. Le modèle original de déplication a été conçu pour englober un sous-ensemble de gènes de résistance par classe d’antibiotiques pour fournir des informations concernant la sous-classe d’antibiotiques pendant le processus de déplication. Aujourd’hui, l’ARP est composé de gènes qui confèrent une résistance à 18 classes d’antibiotiques. À l’aide de notre vaste collection de gènes de résistance, un modèle de déplication secondaire a été développé et est connu sous le nom de plate-forme minimale de résistance aux antibiotiques (MARP). Ce modèle a été créé pour éliminer la redondance génétique et pour simplement fournir des informations concernant la classe générale d’antibiotiques qu’un métabolite déreproduit est lié à. En outre, le modèle MARP possède à la fois wildtype et une souche hyperperméable / efflux déficiente de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 –bamB–tolC), par rapport à l’incarnation originale de l’ARP, qui ne utilise la souche hyperperméable. Cet aspect unique crée des phénotypes supplémentaires pendant la déplication, indiquant une capacité de composés à traverser la membrane externe des bactéries Gram-négatives. Ici, nous décrivons un protocole robuste à suivre lors de la déplication avec l’ARP et/ou le MARP, mettons en évidence les étapes les plus critiques à suivre, et discutons des divers résultats possibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ci-dessus peut être appliqué à la découverte de nouveaux composés antimicrobiens et d’adjuvants qui peuvent être utilisés en conjonction avec les antibiotiques existants pour sauver leur activité. La plate-forme tire parti de la grande spécificité du substrat des mécanismes de résistance et de leurs antibiotiques cognés, pour dématérialiser les composés dans les extraits bruts de produits naturels. Bien que le temps nécessaire à la préparation des plaques de déplication soit long …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche dans le laboratoire Wright relative à l’ARP/MARP a été appuyée par le Fonds de recherche de l’Ontario et la subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (FRN-148463). Nous tenons à remercier Sommer Chou d’avoir aidé à l’expansion et à l’organisation de la bibliothèque de l’ARP.
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
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