אנטיביוטי Dereplication באמצעות פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה
Summary
אנו מתארים פלטפורמה כי מנצל את הספרייה של עמידות לאנטיביוטיקה איזוגניים לdereplication של אנטיביוטיקה . הזהות של אנטיביוטיקה המיוצר על ידי חיידקים או פטריות ניתן להסיק על ידי הצמיחה של E. coli ביטוי ההתנגדות המתאים שלה הגן. פלטפורמה זו יעילה כלכלית וחסכונית בזמן.
Abstract
אחד האתגרים העיקריים בחיפוש אחר אנטיביוטיקה חדשה מתמציות המוצר הטבעי הוא גילוי מחדש של תרכובות נפוצות. כדי להתמודד עם האתגר הזה, dereplication, שהוא תהליך של זיהוי תרכובות ידועות, מבוצע על דגימות של עניין. שיטות לdereplication כגון הפרדה אנליטית ולאחריה ספקטרומטר מסה הינן צורכות זמן רב ועתירות משאבים. כדי לשפר את תהליך dereplication, פיתחנו את פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP). ARP היא ספריה של כ 100 גנים עמידות לאנטיביוטיקה ששוכפל בנפרד לתוך es, coli. אוסף זה הנבג יש יישומים רבים, כולל שיטה חסכונית ונתיישב עבור אנטיביוטיקה dereplication. התהליך כולל תסיסה של חיידקים המייצרים אנטיביוטיקה על פני השטח של מנות פטרי מלבני המכילות בינונית יציבה, ובכך מאפשר הפרשה ודיפוזיה של מטבוליטים משני דרך המדיום. לאחר תקופת תסיסה של 6 ימים, מסירים את ביומסה החיידקים, ומוסיפים לצלחת הפטרי דק שכבת-על כדי ליצור משטח חלק ולאפשר את התפתחותם של זנים מחוון ה-coli . האוסף שלנו של זני ARP מוצמד לאחר מכן על פני השטח של צלחת פטרי המכילה את האנטיביוטיקה. הצלחת היא הדגירה הבאה לילה כדי לאפשר צמיחה E. coli על פני השטח של כיסוי. רק זנים המכילים התנגדות אנטיביוטי ספציפי (או הכיתה) לגדול על פני השטח הזה מאפשר זיהוי מהיר של התרכובת המיוצר. שיטה זו בוצעה בהצלחה לזיהוי יצרנים של אנטיביוטיקה ידועה וכאמצעי לזיהוי אלה המייצרים תרכובות הרומן.
Introduction
מאז גילוי של פניצילין ב 1928, מוצרים טבעיים נגזר מיקרואורגניזמים סביבתיים הוכיחו להיות מקור עשיר של תרכובות מיקרוביאלית1. כ 80% של אנטיביוטיקה המוצר הטבעי נגזרות חיידקים של סוג Streptomyces ואקטיטיטים אחרים, בעוד 20% הנותרים מופק על ידי מינים פטרייתי1. כמה מהפיגומים הנפוצים ביותר לאנטיביוטיקה המשמשים במרפאה כגון β-lactams, טטרציקווים, rifamycins, ו הקוגליניים, היו מבודדים במקור מחיידקים2. עם זאת, בשל עלייתה של עמיד בפני סמים (mdr) חיידקים, פאנל הנוכחי שלנו של אנטיביוטיקה הפך פחות יעיל בטיפול3,4. אלה כוללים את “ESKAPE” פתוגנים (כלומר, vancomycin עמידים בפני בידור ו β-lactam עמידים בפני לקטקוקוס, klebsiella דלקת ריאות, הפסאודומונס aeruginosa, acineטבק הביטוחהעצמי, ו Enterobacter sp.), המהווה תת-ערכה של חיידקים, הנחשבים לבעלי הסיכון הגבוה ביותר על-ידי מספר רשויות בריאות הציבור הגדולות כגון ארגון הבריאות העולמי3,4,5. הופעתה הגלובלית התפשטות של אלה mdr פתוגנים תוצאות הצורך קבוע עבור אנטיביוטיקה הרומן3,4,5. למרבה הצער, שני העשורים האחרונים הוכיחו כי גילוי של אנטיביוטיקה הרומן ממקורות מיקרוביאלית הוא קשה יותר ויותר6. הגישות הנוכחיות לגילוי הסמים כוללות הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות אקטיביים, כולל ספריות מוצר טבעי לחלץ, המאפשר אלפי תמציות להיבדק בזמן נתון2. עם זאת, לאחר מזוהה פעילות מיקרוביאלית, השלב הבא הוא לנתח את התוכן של התמצית גולמי כדי לזהות את הרכיב הפעיל ולסלק את אלה המכילים תרכובות ידועות או יתירים7,8. תהליך זה, המכונה dereplication, חיוני כדי למנוע ו/או להקטין באופן משמעותי את הזמן המושקע בגילוי מחדש של אנטיביוטיקה ידועה7,9. למרות שצעד הכרחי בגילוי הסמים הטבעי של המוצר, dereplication הוא מפרך לשמצה ואינטנסיבי משאבים10.
מאז beutler et al. לראשונה נטבע את המונח “dereplication”, מאמצים נרחבים נעשו כדי לפתח אסטרטגיות חדשניות לזיהוי מהיר של אנטיביוטיקה ידועה11,12. כיום הכלים השכיחים ביותר המשמשים לdereplication כוללים מערכות כרומטוגרפיות אנליטיות כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, ספקטרומטר מסה, ושיטות זיהוי מבוססות תהודה מגנטית גרעינית11,13. למרבה הצער, כל אחת מהשיטות הללו מחייבת שימוש בציוד אנליטי יקר ובפרשנות נתונים מתוחכמת.
בניסיון לפתח שיטה dereplication שניתן לבצע במהירות ללא ציוד מיוחד, הקמנו פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP)10. ARP יכול לשמש לגילוי של שדון אנטיביוטי, הפרופיל של תרכובות אנטיביוטיות חדשות נגד מנגנוני ההתנגדות ידוע, ואת dereplication של אנטיביוטיקה ידועים בתמציות הנגזרות של אקאובקטריה וחיידקים אחרים. כאן, אנו מתמקדים ביישום שלה dereplication אנטיביוטי. ARP מנצל את הספריה של איזוגניים es, המאשכיה זנים המבטא גנים בודדים התנגדות כי הם יעילים נגד אנטיביוטיקה הנפוץ ביותר מחדש גילו14,15. כאשר הספרייה E. coli גדל בנוכחות של אורגניזם משני מייצר מטבוליזם, את הזהות של המתחם ניתן להסיק על ידי הצמיחה של החיידק של E. coli המבטאים הגן הקשור שלה התנגדות10. כאשר ה-ARP דווח לראשונה, הספריה כללה > 40 גנים הענקת עמידות ל -16 שיעורי אנטיביוטי. תבנית הdereplication המקורית תוכננה להקיף תת-ערכה של גנים ההתנגדות לכל מחלקה לאנטיביוטיקה כדי לספק מידע לגבי מחלקת משנה אנטיביוטי בתהליך dereplication. כיום, ה-ARP מורכב מ> 90 גנים המקנים עמידות ל -18 שיעורים אנטיביוטיים. באמצעות האוסף הנרחב שלנו של גנים ההתנגדות, תבנית dereplication משנית פותחה והוא ידוע כפלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה מינימלית (MARP). תבנית זו נוצרה כדי למנוע יתירות גנטית כדי פשוט לספק מידע לגבי המעמד האנטיביוטי הכללי כי מטבוליט dereplicated lite קשורה. בנוסף, התבנית MARP מחזיקה הן מסוג wildtype ואת המתח היתר/לקוי של E. coli BW25113 (e. Coli BW25113 ΔbambΔtolc), לעומת הגלגול המקורי של ה-ARP, אשר רק מנצל את המתח היפרחדיר. היבט ייחודי זה יוצר פנוטיפים נוספים במהלך dereplication, המציין את היכולת תרכובות לחצות את הקרום החיצוני של חיידקים גראם שליליים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק להיות שלאחר מכן כאשר מקבל הפחתה עם ה-ARP ו/או MARP, להדגיש את הצעדים הקריטיים ביותר לעקוב, ולדון בתוצאות אפשריות שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר לעיל יכול להיות מיושם הן גילוי של תרכובות מיקרוביאלית הרומן ושדון שניתן להשתמש בשילוב עם אנטיביוטיקה קיימים כדי להציל את פעילותם. פלטפורמת מנצל את הפלטפורמות הגבוהות של המצע של מנגנוני התנגדות ואנטיביוטיקה קנצוני שלהם, לתרכובות dereplicate בתוך תמציות טבעי גולמי מוצר. למרות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר במעבדת רייט בנוגע ל-ARP/MARP נתמך על ידי קרן מחקר אונטריו ומכונים קנדיים של מלגת מחקר בריאות (FRN-148463). אנו רוצים להכיר בסומר צ’ו על הסיוע בהרחבת ובארגון של ספריית ה-ARP.
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
