항생제 내성 플랫폼을 이용한 항생제 복제
Summary
우리는 항생제의 복제를 위한 이소제닉 항생제 저항하는 대장균의 도서관을 이용하는 플랫폼을 기술합니다. 박테리아 또는 곰팡이에 의해 생성된 항생제의 정체성은 각각의 내성 유전자를 발현하는 대장균의 성장에 의해 추론될 수 있다. 이 플랫폼은 경제적으로 효과적이고 시간 효율적입니다.
Abstract
천연 물 추출물에서 새로운 항생제에 대 한 검색에 주요 과제 중 하나는 일반적인 화합물의 재발견. 이 문제를 해결하기 위해 알려진 화합물을 식별하는 프로세스인 복제 해제가 관심 있는 샘플에서 수행됩니다. 분석 분리와 질량 분석과 같은 복제 를 위한 방법은 시간이 많이 걸리고 리소스집약적입니다. 복제 를 개선하기 위해 항생제 내성 플랫폼 (ARP)을 개발했습니다. ARP는 대장균에 개별적으로 복제된 약 100개의 항생제 내성 유전자의 라이브러리입니다. 이 균주 수집은 항생제 복제를 위한 비용 효과적이고 허구적인 방법을 포함하여 많은 응용을 가지고 있습니다. 이 과정은 고체 배지를 포함하는 직사각형 페트리 접시의 표면에 항생제 생산 미생물의 발효를 수반하여 매체를 통해 이차 대사 산물의 분비 및 확산을 허용합니다. 6일 발효 기간 이후에 미생물 바이오매스를 제거하고, 얇은 한천 오버레이를 페트리 접시에 첨가하여 매끄러운 표면을 만들고 대장균 표시기 균주의 성장을 가능하게 한다. ARP 균주의 우리의 컬렉션은 다음 항생제 함유 페트리 접시의 표면에 고정된다. 플레이트는 오버레이의 표면에 대장균 성장을 허용하기 위해 밤새 배양된다. 특정 항생제 (또는 클래스)에 대한 내성을 포함하는 균주만이 이 표면에서 성장하여 생성된 화합물을 신속하게 식별할 수 있습니다. 이 방법은 알려진 항생제의 생산자의 식별및 새로운 화합물을 생산하는 사람들을 식별하는 수단으로 성공적으로 사용되었습니다.
Introduction
1928년 페니실린이 발견된 이래, 환경 미생물에서 유래한 천연물은 항균 화합물의 풍부한 공급원인 것으로 입증되었다1. 천연물 항생제의 약 80%는 연쇄상 구균 과 다른 액티노마이세테 속의 박테리아에서 유래하며, 나머지 20%는 곰팡이 종1에의해 생성됩니다. β-락탐, 테트라사이클린, 리파마이신 및 아미노글리코시드와 같은 클리닉에서 사용되는 가장 일반적인 항생제 스캐폴드 중 일부는 원래 미생물2로부터분리되었다. 그러나, 다중 약 저항하는 (MDR) 박테리아의 상승 때문에, 항생제의 우리의 현재 패널은 처리에 있는 보다 적게 효과적이되었습니다3,4. 이들은 “ESKAPE” 병원체 (즉, 반코마이신 내성 장구균 및 β-락탐 내성 황색포도상구균, Klebsiella pneumoniae, 슈도모나스 aeruginosa, 아신토박터 보만니,및 Enterobacter sp.), 이는 세계보건기구(WHO)3,4,5와같은 다수의 주요 공중 보건 당국에 의해 가장 높은 위험과 연관된 것으로 간주되는 박테리아의 하위 집합이다. 이 MDR 병원체의 출현 그리고 세계적인 퍼짐은 새로운 항생제3,4,5를위한 지속적인 필요 귀착됩니다. 유감스럽게도, 지난 2 년간은 미생물 근원에서 새로운 항생제의 발견이 점점 더 어렵다는 것을 보여주었습니다6. 약물 발견에 대한 현재의 접근법에는 천연물 추출물 라이브러리를 포함한 생리 활성 화합물의 높은 처리량 스크리닝이 포함되며, 주어진 시간에 수천 개의 추출물을 테스트 할 수 있습니다2. 그러나, 일단 항균 활성이 검출되면, 다음 단계는 활성 성분을 식별하고 공지된 또는 중복화합물을함유하는 것을 제거하기 위해 원유 추출물의 함량을 분석하는7,8이다. 복제를 복제라고 하는 이 프로세스는 알려진항생제7,9의재발견에 소요되는 시간을 방지 및/또는 현저하게 줄이는 데 필수적입니다. 천연물 신약 발견에 필요한 단계이지만, 복제 는 악명 높고 자원 집약적인 10입니다.
Beutler 등은 “복제”라는 용어를 처음 만든 이래로 알려진 항생제11,12의신속한 식별을 위한 혁신적인 전략을 개발하기 위한 광범위한 노력이 이루어졌습니다. 오늘날 복제에 사용되는 가장 일반적인 도구는 고성능 액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 핵 자기 공명 기반 검출 방법11,13과같은 분석 크로마토그래피 시스템을 포함한다. 안타깝게도 이러한 각 방법은 값비싼 분석 장비와 정교한 데이터 해석을 사용해야 합니다.
전문장비 없이 도신속하게 수행할 수 있는 복제방법을 개발하기 위해 항생제 내성 플랫폼(ARP)10을구축하였다. ARP는 항생제 보조제의 발견, 알려진 내성 메커니즘에 대한 새로운 항생제 화합물의 프로파일링 및 액티노박테리아 및 기타 미생물에서 유래한 추출물에서 알려진 항생제의 복제에 사용될 수 있다. 여기에서는 항생제 복제에 대한 적용에 중점을 둡니다. ARP는 가장 일반적으로 재발견된 항생제14,15에대하여 효과적인 개별 저항 유전자를 발현하는 이소제닉 대장균 균주의 라이브러리를 이용한다. 대장균 라이브러리가 이차 대사산물 생산 유기체의 존재 내에서 성장될 때, 화합물의 정체성은 관련 저항 유전자10을발현하는 대장균 균주의 성장에 의해 추론될 수 있다. ARP가 처음 보고되었을 때, 도서관은 16개의 항생제 클래스에 저항성을 부여하는 >40 유전자로 구성되었습니다. 본래의 복제 템플릿은 복제 과정 동안 항생제 하위 클래스에 관한 정보를 제공하기 위해 항생제 클래스당 저항 유전자의 하위 집합을 포괄하도록 설계되었습니다. 오늘, ARP는 18개의 항생제 클래스에 저항을 부여하는 >90 유전자로 이루어져 있습니다. 저항 유전자의 우리의 광대한 컬렉션을 사용하여, 이차 복제 템플릿은 개발되고 최소한의 항생 저항 플랫폼으로 알려져 있다 (MARP). 이 템플릿은 유전자 중복성을 제거하고 단순히 복제 된 대사 산물과 관련된 일반적인 항생제 클래스에 관한 정보를 제공하기 위해 만들어졌습니다. 또한 MARP 템플릿은 ARP의 원래 화신과 비교하여 대장균 BW25113(대장균 BW25113 ΔbamBΔtolC)의야생 유형 및 과다 투과성 /유출 성 균주를 모두 보유하고 있습니다. 과다 투과성 변형을 활용합니다. 이 독특한 양상은 그람 음성 박테리아의 외부 막을 교차하는 화합물 능력을 나타내는, 복제 를 하는 동안 추가 표현형을 만듭니다. 여기서는 ARP 및/또는 MARP로 복제할 때 따라야 할 강력한 프로토콜을 설명하고 따라야 할 가장 중요한 단계를 강조 표시하고 다양한 가능한 결과를 논의합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전술한 프로토콜은 그들의 활성을 구출하기 위해 기존 항생제와 함께 사용될 수 있는 신규한 항균 화합물 및 보조제의 발견 모두에 적용될 수 있다. 이 플랫폼은 내성 메커니즘과 동종 항생제의 높은 기질 특이성을 활용하여 원유 천연 물추출물 내에서 화합물을 복제합니다. 복제 플레이트를 준비하는 데 필요한 시간이 길지만(~2주), 복제 프로세스 자체는 단일 하룻밤 잠복기 후에 완료되며, 이는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ARP/MARP에 관련 된 라이트 실험실에서 연구 온타리오 연구 기금 및 건강 연구 보조금의 캐나다 연구소에 의해 지원 되었다 (FRN-148463). 우리는 ARP 라이브러리의 확장 및 구성을 지원 한 Sommer Chou를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
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