Dereplication antibiotico utilizzando la piattaforma di resistenza agli antibiotici

Summary

Descriviamo una piattaforma che utilizza una libreria di Escherichia coli resistente agli antibiotici isogenici per la dereplicazione degli antibiotici. L’identità di un antibiotico prodotto da batteri o funghi può essere dedotta dalla crescita di E. coli che esprime il suo rispettivo gene di resistenza. Questa piattaforma è economicamente efficace ed efficiente in termini di tempo.

Abstract

Una delle principali sfide nella ricerca di nuovi antibiotici da estratti di prodotti naturali è la riscoperta di composti comuni. Per affrontare questa sfida, la dereplicazione, che è il processo di identificazione dei composti noti, viene eseguita su campioni di interesse. I metodi per la dereplicazione, ad esempio la separazione analitica seguita dalla spettrometria di massa, richiedono molto tempo e richiedono molto tempo. Per migliorare il processo di dereplicazione, abbiamo sviluppato la piattaforma di resistenza agli antibiotici (ARP). L’ARP è una libreria di circa 100 geni di resistenza agli antibiotici che sono stati clonati individualmente in Escherichia coli. Questa raccolta di ceppi ha molte applicazioni, tra cui un metodo facile e conveniente per la dereplicazione antibiotica. Il processo prevede la fermentazione di microbi che producono antibiotici sulla superficie di piatti Petri rettangolari contenenti mezzo solido, consentendo così la secrezione e la diffusione di metaboliti secondari attraverso il mezzo. Dopo un periodo di fermentazione di 6 giorni, la biomassa microbica viene rimossa e una sottile sovrapposizione di agar viene aggiunta alla parabola Petri per creare una superficie liscia e consentire la crescita dei ceppi dell’indicatore E. coli. La nostra collezione di ceppi ARP viene poi appuntata sulla superficie del piatto Petri che contiene antibiotici. La piastra viene successivamente incubata durante la notte per consentire la crescita di E. coli sulla superficie della sovrapposizione. Solo i ceppi contenenti resistenza a un antibiotico (o classe) specifico crescono su questa superficie consentendo una rapida identificazione del composto prodotto. Questo metodo è stato utilizzato con successo per l’identificazione dei produttori di antibiotici noti e come mezzo per identificare quelli che producono nuovi composti.

Introduction

Dalla scoperta della penicillina nel 1928, i prodotti naturali derivati da microrganismi ambientali hanno dimostrato di essere una ricca fonte di composti antimicrobici¹. Circa l’80% degli antibiotici del prodotto naturale sono derivati da batteri del genere Streptomyces e altri actinomycetes, mentre il restante 20% è prodotto da specie fungine¹. Alcuni degli scaffold antibiotici più comuni utilizzati nella clinica, come i lactam, le tetracicline, i rifamycin e gli amminocolici, erano originariamente isolati dai microbi². Tuttavia, a causa dell’aumento dei batteri multifarmacoresistenti (MDR), il nostro attuale gruppo di antibiotici è diventato meno efficace nel trattamento^3,4. Questi includono gli agenti patogeni “ESKAPE” (cioè enterococci resistenti alla vancomicina e Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinebacter baumannii, e Enterobacter sp.), che sono un sottoinsieme di batteri ritenuti associati al più alto rischio da un certo numero di importanti autorità sanitarie pubbliche come l’Organizzazione Mondiale della Sanità^3,4,5. L’emergere e la diffusione globale di questi patogeni MDR si traduce in un costante bisogno di nuovi antibiotici^3,4,5. Purtroppo, gli ultimi due decenni hanno dimostrato che la scoperta di nuovi antibiotici da fonti microbiche è sempre più difficile⁶. Gli attuali approcci alla scoperta di farmaci includono lo screening ad alto consumo di composti bioattivi, comprese le librerie di estratti di prodotto naturali, consentendo il test di migliaia di estratti in un dato momento². Tuttavia, una volta rilevata l’attività antimicrobica, il passo successivo è quello di analizzare il contenuto dell’estratto grezzo per identificare il componente attivo ed eliminare quelli che contengono composti noti o ridondanti^7,8. Questo processo, denominato dereplicare, è fondamentale per prevenire e/o ridurre significativamente il tempo dedicato alla riscoperta di antibiotici noti^7,9. Anche se un passo necessario nella scoperta di farmaci di prodotto naturale, dereplication è notoriamente laborioso e ad alta intensità di^{risorse 10}.

Da quando Beutler et al. per la prima volta ha coniato il termine “dereplication”, sono stati fatti sforzi ampi per sviluppare strategie innovative per la rapida identificazione degli antibiotici noti^11,12. Oggi gli strumenti più comuni utilizzati per la dereplicazione includono sistemi cromatografici analitici come la cromatografia liquida ad alte prestazioni, la spettrometria di massa e i metodi di rilevamento basato sulla risonanza magnetica nucleare^11,13. Purtroppo, ognuno di questi metodi richiede l’uso di costose apparecchiature analitiche e un’interpretazione sofisticata dei dati.

Nel tentativo di sviluppare un metodo di dereplicazione che può essere eseguito rapidamente senza attrezzature specializzate, abbiamo stabilito la piattaforma di resistenza agli antibiotici (ARP)¹⁰. L’ARP può essere utilizzato per la scoperta di adiuvanti antibiotici, la profilazione di nuovi composti antibiotici contro meccanismi di resistenza noti e la dereplicazione di antibiotici noti in estratti derivati da actinobatteri e altri microbi. Qui, ci concentriamo sulla sua applicazione nella dereplicazione antibiotica. L’ARP utilizza una libreria di ceppi isogenici di Escherichia coli che esprimono singoli geni di resistenza che sono efficaci contro gli antibiotici più comunemente riscoperti^14,15. Quando la biblioteca E. coli viene coltivata in presenza di un organismo secondario che produce metaboliti, l’identità del composto può essere dedotta dalla crescita di ceppi di E. coli che esprimono il suo gene di resistenza associato¹⁰. Quando l’ARP è stato segnalato per la prima volta, la biblioteca consisteva di >40 geni che conferevano resistenza a 16 classi di antibiotici. Il modello originale di dereplicazione è stato progettato per comprendere un sottoinsieme di geni della resistenza per classe di antibiotici per fornire informazioni riguardanti la sottoclasse di antibiotici durante il processo di dereplicazione. Oggi, l’ARP è composto da >90 geni che conferiscono resistenza a 18 classi di antibiotici. Utilizzando la nostra vasta collezione di geni di resistenza, è stato sviluppato un modello di dereplicazione secondario ed è noto come la piattaforma di resistenza agli antibiotici minima (MARP). Questo modello è stato creato per eliminare la ridondanza genica e per fornire semplicemente informazioni riguardanti la classe antibiotica generale a cui è correlato un metabolita. Inoltre, il modello MARP possiede sia wildtype che un ceppo iperpermeabile/efflusso carente di E. coli BW25113(E. coli BW25113 –bam B–tolC), rispetto all’incarnazione originale dell’ARP, che solo utilizza il ceppo iperpermeabile. Questo aspetto unico crea fenotipi aggiuntivi durante la dereplicazione, indicando una capacità di composti di attraversare la membrana esterna dei batteri Gram-negativi. Qui, descriviamo un protocollo robusto da seguire quando descriviamo con l’ARP e/o la MARP, evidenziamo i passaggi più critici da seguire e discutiamo i vari possibili risultati.

Protocol

1. Preparazione di E. coli Library Glycerol Stocks (da Agar Slants) Streak i ceppi ARP/MARP E. coli dal brodo di lisogenia (LB) agar obise piatti Petri contenenti agar LB e il marcatore selezionabile appropriato (Tabella 1). Preparare le colture per ciascuno dei ceppi di E. coli inoculando 3 mL di LB contenenti il marcatore selezionabile appropriato con una singola colonia. Coltivare durante la notte a 37 gradi centigradi con aerazione (250 giri/min). …

Representative Results

I seguenti risultati sono stati ottenuti quando una raccolta di ceppi di interesse che producono antibiotici è stata dereplicata utilizzando l’ARP e/o la MARP. Un diagramma del flusso di lavoro di dereplica ARP/MARP è illustrato nella Figura 1e le mappe a piastre della libreria sono illustrate nella figura supplementare 1 e nella figura supplementare 2. Figura 2 dimostra un risultato positivo di der…

Discussion

Il protocollo sopra descritto può essere applicato sia alla scoperta di nuovi composti antimicrobici e di adiuvanti che possono essere utilizzati in combinazione con antibiotici esistenti per salvare la loro attività. La piattaforma sfrutta l’elevata specificità del substrato dei meccanismi di resistenza e dei loro antibiotici in cognato, per dereplicare i composti all’interno di estratti di prodotti naturali grezzi. Anche se il tempo necessario per la preparazione delle piastre di dereplicazione è lungo (2 settimane…

Materials

Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	–	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2