Summary

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

Published: October 17, 2019
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Summary

抗生物質の脱複製に対する同種抗生物質耐性エシェリヒア大腸菌のライブラリーを利用するプラットフォームについて述べる。細菌または真菌によって産生される抗生物質の同一性は、それぞれの耐性遺伝子を発現する大腸菌の増殖によって推定することができる。このプラットホームは経済的に有効で、時間効率が良い。

Abstract

天然物抽出物からの新しい抗生物質の探索における主な課題の1つは、一般的な化合物の再発見です。この課題に対処するために、既知の化合物を同定するプロセスである脱複製が目的のサンプルに対して行われます。分析分離、質量分析などの脱複製の方法は、時間とリソースを大量に消費します。脱複製プロセスを改善するために、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)を開発しました。ARPは、エシェリヒア大腸菌に個別にクローニングされた約100の抗生物質耐性遺伝子のライブラリーです。この株のコレクションは、抗生物質の脱複製のための費用対効果の高い、顔の良い方法を含む多くのアプリケーションを持っています。このプロセスは、固体媒体を含む長方形ペトリ皿の表面に抗生物質産生微生物を発酵させ、それによって培地を介した二次代謝産物の分泌および拡散を可能にする。6日間の発酵期間の後、微生物バイオマスを除去し、薄い寒天オーバーレイをペトリ皿に加えて滑らかな表面を作成し、大腸菌指標株の成長を可能にします。ARP株の私たちのコレクションは、抗生物質含有ペトリ皿の表面に固定されます。プレートは、オーバーレイの表面に大腸菌の成長を可能にするために、次に一晩インキュベートされます。特定の抗生物質(またはクラス)に対する耐性を含む株のみがこの表面上で成長し、生成された化合物の迅速な同定を可能にする。この方法は、既知の抗生物質の生産者の同定と、新しい化合物を産生するものを同定する手段として正常に使用されている。

Introduction

1928年にペニシリンが発見されて以来、環境微生物由来の天然物は、抗菌化合物1の豊富な供給源であることが証明されている。天然物系抗生物質の約80%はストレプトマイセス属および他の多発性菌の細菌に由来し、残りの20%は真菌種1によって産生される。β-ラクタム、テトラサイクリン、リファマイシン、アミノグリコシドなどの診療所で使用される最も一般的な抗生物質足場のいくつかは、もともと微生物2から単離された。しかし、多剤耐性(MDR)細菌の増加により、現在の抗生物質のパネルは治療3、4であまり効果がなくなってきています。これらには、「ESKAPE」病原体(すなわち、バンコマイシン耐性腸球菌およびβ-ラクタム耐性黄色ブドウ球菌、クレブシエラ肺炎、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、およびエンテロバクターsp.)は、世界保健機関(WHO)3、4、5などの多くの主要な公衆衛生当局によって最も高いリスクに関連していると考えられる細菌のサブセットである。これらのMDR病原体の出現とグローバルな広がりは、新しい抗生物質3、4、5の絶え間ない必要性をもたらす。残念ながら、過去20年間で、微生物源からの新しい抗生物質の発見はますます困難であることを実証している6.創薬に対する現在のアプローチには、天然物抽出ライブラリーを含む生理活性化合物のハイスループットスクリーニングが含まれており、所定の時間2で何千もの抽出物を試験することができる。しかし、抗菌活性が検出されると、次のステップは、原油抽出物の内容物を分析して活性成分を同定し、既知または冗長化合物7、8を含むものを排除する。このプロセスは、脱複製と呼ばれ、既知の抗生物質7、9の再発見に費やされる時間を防止および/または大幅に短縮するために不可欠である。天然物創薬の必要なステップですが、脱複製は、非常に手間がかかり、リソース集約的な10.

Beutlerらは、最初に「脱複製」という用語を造語して以来、既知の抗生物質11、12の迅速な同定のための革新的な戦略を開発するための広範な努力がなされてきた。今日、脱複製に使用される最も一般的なツールには、高性能液体クロマトグラフィー、質量分析、および核磁気共鳴ベースの検出方法11、13などの分析クロマトグラフィーシステムが含まれる。残念ながら、これらの方法のそれぞれは、高価な分析機器と高度なデータ解釈の使用を必要とします。

特殊な装置なしで迅速に行うことができる脱複製法を開発する試みとして、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)10を確立した。ARPは、抗生物質アジュバントの発見、既知の耐性機構に対する新しい抗生物質化合物のプロファイリング、およびアクチノバクテリアおよび他の微生物由来の抽出物における既知の抗生物質の脱複製に使用することができる。ここでは、抗生物質の脱複製におけるその応用に焦点を当てる。ARPは、最も一般的に再発見された抗生物質14,15に対して有効である個々の抵抗遺伝子を発現する等方性エシェリヒア大腸菌ライブラリーを利用する。大腸菌ライブラリーが二次代謝産物産生生物の存在下で成長すると、化合物の同一性は、関連する耐性遺伝子10を発現する大腸菌株の増殖によって推測されうる。ARPが最初に報告されたとき、ライブラリーは16の抗生物質クラスに対する耐性を与える>40遺伝子で構成されていました。元の脱複製テンプレートは、脱複製プロセス中に抗生物質サブクラスに関する情報を提供するために、抗生物質クラスごとの耐性遺伝子のサブセットを包含するように設計されました。今日、ARPは18の抗生物質クラスに対する抵抗性を与える>90遺伝子で構成されている。耐性遺伝子の広範なコレクションを使用して、二次脱複製テンプレートが開発され、最小抗生物質耐性プラットフォーム(MARP)として知られています。このテンプレートは、遺伝子の冗長性を排除し、単に脱複製された代謝産物が関連する一般的な抗生物質クラスに関する情報を提供するために作成されました。さらに、MARPテンプレートは、野生型と大菌BW25113(大腸菌BW25113ΔbamBΔtolC)の両方の肥一性/流出欠損株の両方を有し、ARPの元の化身と比較して、唯一の過透過性株を利用する。このユニークな側面は、脱複製中に追加の型を作成し、グラム陰性細菌の外膜を横断する化合物能力を示す。ここでは、ARP または MARP を使用して複製を解除する際に従うべき堅牢なプロトコルについて説明し、従うべき最も重要な手順を強調し、さまざまな可能な結果について説明します。

Protocol

1.大腸菌ライブラリーグリセロールストックの調製(寒天スラントから) ARP/MARP大腸菌株を、LB寒天と適切な選択マーカーを含むペトリ皿にリソジェニーブロス(LB)寒天のスラングからストリークします(表1)。 1つのコロニーで適切な選択可能なマーカーを含むLBの3 mLを接種することにより、大腸菌株の各培養物を調記する。通気(250 rpm)で37°Cで一晩?…

Representative Results

以下の結果は、ARPおよび/またはMARPを使用して抗生物質産生株のコレクションが非複製された場合に得られた。 ARP/MARP 脱複製ワークフローの図を図 1に示し、ライブラリ プレート マップを補足図 1および補足図 2 に示します。図2は、環境抽出物WAC 8921がクロラムフェニコール生産者として同定される?…

Discussion

上記のプロトコルは、その活性を救出するために既存の抗生物質と組み合わせて使用することができる新しい抗菌化合物およびアジュバントの両方の発見に適用することができる。プラットフォームは、耐薬品抽出物内の化合物を脱複製するために、抵抗機構とその認知抗生物質の高い基質特異性を利用します。脱複製プレートの調製に要する時間は長い(~2週間)が、一晩のインキュベーショ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ARP/MARPに関するライトラボの研究は、オンタリオ州研究基金とカナダ保健研究所助成金(FRN-148463)によって支援されました。我々は、ARPライブラリの拡張と組織を支援したソマー・チョウを認めたい。

Materials

Agar Bio Shop AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage Sigma-Aldrich Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt Bio Shop AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton Dickinson 212322
BBL Phytone Peptone (Soytone) Becton Dickinson 211906
Calcium Carbonate Bio Shop CAR303.500
Casamino acid Bio Basic 3060
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour Sarstedt 72.379.992
D-glucose Bio Shop GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm Fisher Scientific 14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous Commercial Alcohols P016EAAN
Glass Beads, Solid Fisher Scientific 11-312C
Glycerol Bio Shop GLY001.4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Instant sealing sterilization pouch Fisher Scientific 01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich F7002-250G
Kanamycin Sulfate Bio Shop KAN201.50
LB Broth Lennox Bio Shop LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size Millipore-Sigma HAWP00010 10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base Sarstedt 82.1582.001
New Brunswick Innova 44 Eppendorf M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Fisher Scientific 264728 with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams Sarstedt 82.1473.001
Pinning tools ETH Zurich Custom order
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potato starch Bulk Barn 279
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium Nitrate Fisher Scientific S343-500
Wood Applicators Dukal Corporation 9000
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2

References

  1. Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
  2. Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
  3. Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
  4. Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
  5. Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
  6. Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
  7. Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
  8. Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
  9. Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
  10. Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
  11. Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  12. Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
  13. Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
  14. Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
  15. Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).

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Cite This Article
Zubyk, H. L., Cox, G., Wright, G. D. Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform. J. Vis. Exp. (152), e60536, doi:10.3791/60536 (2019).

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