Антибиотическая дерепликация с использованием платформы устойчивости к антибиотикам
Summary
Мы описываем платформу, которая использует библиотеку изогенных устойчивых к антибиотикам Escherichia coli для дерепликации антибиотиков. Идентичность антибиотика, вырабатываемого бактериями или грибами, может быть выведена ростом кишечной палочки, выражающей свой ген резистентности. Эта платформа является экономически эффективной и действенной по времени.
Abstract
Одной из основных проблем в поиске новых антибиотиков из экстрактов натуральных продуктов является повторное открытие общих соединений. Для решения этой проблемы, dereplication, который является процесс идентификации известных соединений, осуществляется на образцах, представляющих интерес. Методы дерепликации, такие как аналитическое разделение с последующей масс-спектрометрией, отнимают много времени и ресурсоемки. Для улучшения процесса дерепликации мы разработали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP). ARP представляет собой библиотеку из примерно 100 генов устойчивости к антибиотикам, которые были индивидуально клонированы в кишечную палочку. Эта коллекция штаммов имеет много применений, в том числе экономически эффективный и поверхностный метод для антибиотиков dereplication. Этот процесс включает в себя брожение антибиотикопроизводящих микробов на поверхности прямоугольных блюд Петри, содержащих твердую среду, тем самым позволяя секрецию и диффузию вторичных метаболитов через среду. После 6-дневного периода брожения микробная биомасса удаляется, а в блюдо Петри добавляется тонкая агар-накладка, чтобы создать гладкую поверхность и обеспечить рост штаммов индикатора кишечной палочки. Наша коллекция штаммов ARP затем прикрепляется на поверхность антибиотикосодержащей чашки Петри. Пластина следующий инкубируется на ночь, чтобы обеспечить рост кишечной палочки на поверхности наложения. Только штаммы, содержащие устойчивость к конкретному антибиотику (или классу), растут на этой поверхности, что позволяет быстро идентифицировать произведенное соединение. Этот метод успешно используется для выявления производителей известных антибиотиков и в качестве средства для выявления лиц, производящих новые соединения.
Introduction
С момента открытия пенициллина в 1928 году натуральные продукты, полученные из экологических микроорганизмов, оказались богатым источником противомикробных соединений1. Приблизительно 80% антибиотиков натурального продукта получены из бактерий рода Streptomyces и других актиномицетов, в то время как остальные 20% производится грибковых видов1. Некоторые из наиболее распространенных антибиотиков леса, используемые в клинике, такие как к-лактамы, тетрациклины, рифамицины, и аминогликозиды, были первоначально изолированы от микробов2. Однако, в связи с ростом бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), наша текущая панель антибиотиков стала менее эффективной в лечении3,4. К ним относятся патогенные микроорганизмы “ESKAPE” (т.е. ванкомицин-устойчивые энтерококки и лактам-резистентный золотистый стафилококк, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacter sp.), которые являются подмножеством бактерий, которые считаются связанными с самым высоким риском ряда крупных органов общественного здравоохранения, таких как Всемирная организация здравоохранения3,4,5. Появление и глобальное распространение этих патогенов МЛУ приводит к постоянной потребности в новых антибиотиках3,4,5. К сожалению, последние два десятилетия показали, что открытие новых антибиотиков из микробных источников становится все труднее6. Текущие подходы к открытию наркотиков включают высокопроизводительный скрининг биологически активных соединений, включая библиотеки экстракта природного продукта, что позволяет проверить тысячи экстрактов в данный момент2. Однако, как только антимикробная активность обнаружена, следующим шагом является анализ содержимого сырого экстракта для выявления активного компонента и устранения тех, которые содержат известные или избыточные соединения7,8. Этот процесс, называемый дерепликцией, имеет жизненно важное значение для предотвращения и / или значительно сократить время, затрачиваемые на повторное открытие известных антибиотиков7,9. Хотя необходимый шаг в открытии натуральных продуктов наркотиков, dereplication, как известно, трудоемким и ресурсоемким10.
С тех пор как Beutler et al. впервые придумалтермин “дерепликация”, были предприняты активные усилия по разработке инновационных стратегий для быстрого выявления известных антибиотиков11,12. Сегодня наиболее распространенными инструментами, используемыми для дерепликации, являются аналитические хроматографические системы, такие как высокопроизводительная жидкая хроматография, масс-спектрометрия и методы обнаружения ядерного магнитного резонанса11,13. К сожалению, каждый из этих методов требует использования дорогостоящего аналитического оборудования и сложной интерпретации данных.
В попытке разработать метод дерепликации, который может быть быстро выполнен без специализированного оборудования, мы создали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP)10. ARP может быть использован для открытия антибиотиков адъювантов, профилирование новых соединений антибиотиков против известных механизмов устойчивости, и dereplication известных антибиотиков в экстрактах, полученных из актинобактерий и других микробов. Здесь мы сосредоточимся на его применении в антибиотико-дерепликации. ARP использует библиотеку изогенных штаммов Escherichia coli, выражающих индивидуальные гены резистентности, которые эффективны против наиболее часто открываемых антибиотиков14,15. Когда библиотека кишечной палочки выращивается в присутствии вторичного метаболита-производящего организма, идентичность соединения может быть выведена ростом штаммов кишечной палочки, которые выражают связанный с ним ген резистентности10. Когда ARP впервые было сообщено, библиотека состояла из генов, придающих устойчивость к 16 классам антибиотиков. Оригинальный шаблон дерепликации был разработан, чтобы охватить подмножество генов устойчивости в классе антибиотиков, чтобы предоставить информацию о подклассе антибиотиков в процессе дерепликации. Сегодня, ARP состоит из генов, которые дают устойчивость к 18 классам антибиотиков. Используя нашу обширную коллекцию генов резистентности, был разработан вторичный шаблон дерепликации, который известен как платформа минимальной устойчивости к антибиотикам (MARP). Этот шаблон был создан для устранения избыточности генов и просто предоставить информацию об общем классе антибиотиков, с которым связан дереплицированный метаболит. Кроме того, шаблон MARP обладает как диким типом, так и гиперпроницаемым/дефицитным штаммом E. coli BW25113 (E. coli BW25113 ,bamB использует гиперпроницаемый штамм. Этот уникальный аспект создает дополнительные фенотипы во время дерепликации, указывая на способность соединений пересекать внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий. Здесь мы описываем надежный протокол, которым следует следовать при дерепликации либо с ARP и/или MARP, очерчив наиболее важные шаги, которым следует следовать, и обсудим различные возможные результаты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный выше протокол может применяться как к открытию новых противомикробных соединений, так и к адъювантам, которые могут быть использованы в сочетании с существующими антибиотиками для спасения их деятельности. Платформа использует высокую специфичность субстрата механизмов р?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории Райта, относящиеся к ARP/MARP, были поддержаны Исследовательским фондом Онтарио и канадскими институтами исследований в области здравоохранения (FRN-148463). Мы хотели бы поблагодарить Соммера Чоу за содействие в расширении и организации библиотеки ARP.
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
