Summary
Denne protokol giver en trinvis procedure til analyse af aterosklerotisk byrde hos mus. Efterforskere kan bruge denne protokol til at sammenligne overflod, placering og størrelse af aterosklerotiske læsioner hos forskellige dyr.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe)- eller lipoproteinreceptor med lav densitet (Ldlr)-mangelfulde hyperlipidæmiske mus er de to mest anvendte modeller til ateroskleroseforskning. De bruges til at studere virkningen af forskellige genetiske faktorer og forskellige celletyper på aterosklerotisk læsionsdannelse og samt teste udviklingen af nye terapier. Isolering, udskæring af hele aorta og kvantificering af olierød o-farvede aterosklerotiske læsioner er grundlæggende morfometriske metoder, der anvendes til at evaluere aterosklerotisk byrde. Målet med denne protokol er at beskrive en optimeret, trin-for-trin kirurgisk metode til at dissekere, perfuse-fixe, isolere, plette, afbilde og analysere aterosklerotiske læsioner i museaortas med OlieRød O. Fordi atherosklerotiske læsioner kan dannes hvor som helst i hele aortatræet, har hele denne aorta Oil Red O-farvningsmetode fordelen ved at evaluere lipidbelastede plaques i hele aorta og alle grene i en enkelt mus. Ud over Oil Red O-farvning kan friske isolerede hele aortas bruges til forskellige in vitro- og in vivo-eksperimenter og celleisoleringer.
Introduction
Koronararteriesygdom, en førende årsag til dødelighed i USA, er normalt forårsaget af aterosklerose, en proces, der fører til opbygning af plak inde i arterielle vægge1. Hyperlipidæmi-tilbøjelige Apoe- og Ldlr-mangelfulde mus er centrale for undersøgelser af aterosklerose og dens komplikationer og udvikling af terapier2,3,4,5. Kvantificering af aterosklerotiske læsioner fra en en face aorta er en vigtig endepunktsanalyse til evaluering af virkningen af genetisk manipulation i forskellige celletyper. Det hjælper også med at studere nye terapier designet til at påvirke initiering af aterosklerotisk sygdom, progression og regression. Aterosklerotiske læsioner kan dannes hvor som helst i aorta og dets grene (dvs. brachiocephalic, carotis og subclavian arterier i brystet samt nyre,almindelig iliac og lårbensarterier under membranen)6. En omfattende evaluering af åreforkalkningsbyrden og passende behandling kræver vurdering af sygdomsbyrden forskellige steder, en udfordring, der ofte overses.
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører en omfattende analyse af aterosklerotiske læsioner, der starter med en uåbnet hel aorta og fortsætter til en ansigtsforberedelse i en enkelt mus. Uåbnet hel aorta Oil Red O-farvning muliggør hurtig, kvalitativ vurdering af lipidbelastede plaques i hele aorta og dens grene, mens en ansigtsforberedelse giver en kvantitativ vurdering af aterosklerotisk læsionsfordeling i musens aorta.
Teknikken bruger 8 uger gamle mus med en glat muskelcellespecifik TGFβR2-deletion på apoe-/- hyperlipidæmisk baggrund (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; i det følgende benævnt TGFβR2iSMC-Apoe-mus) og kuldmat Apoe-/- kontroller (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; i det følgende benævnt Apoe-/- mus). Dyrene holdes i 16 uger på en fedtrig kost med højt kolesteroltal (HCHFD) som undersøgelsesmateriale7. Ved undersøgelsens afslutning farves og afbildes de uåbnede hele aortaer (inklusive alle større grene) med Olierød O til kvalitativ vurdering af lipidbelastede plaques. Aortaerne skæres op via en ansigtsforberedelse, og alle aterosklerotiske læsioner afbildes og kvantificeres. Denne protokol kan bruges til at studere aterosklerotisk læsionsudvikling i Apoe-/- eller Ldlr-/- hyperlipidæmimusmodeller og udvides til generelle aorta-relaterede vaskulære biologiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mT/mG (lagernr. 007676) og Apoe-/- (lagernr. 002052) mus blev købt fra Jackson Laboratory. Myh11-CreERT2 mus var en gave fra Stefan Offermanns (fås fra Jackson Laboratory som lager nr. 019079). Tgfbr2fl/fl mus blev opnået fra Harold L. Moses (Vanderbilt University). Alle dyreforsøg blev udført ved hjælp af protokoller godkendt af Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Mus
- Producer MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- og MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- mus som tidligere beskrevet7. Breed mutant stammer til C57BL/6J baggrund i mere end ti generationer.
BEMÆRK: Myh11-CreERT2 Cre-muselinjen giver et kraftfuldt værktøj til at studere rollen som glatte muskelceller i vaskulær homeostase og vaskulær patologi. Cre-allelen indsættes i Y-kromosomet; således udtrykker hunmus ikke denne konstruktion.
2. Mus genotyping, tamoxifen induktion og højt kolesterol højt fedtindhold kost fodring
- Udfør musegenolyping ved hjælp af museøre-DNA og PCR-analyse. Musens øre-DNA skal isoleres ved hjælp af blod- og vævs-DNA-isoleringssættet (Table of Materials) i henhold til producentens anvisninger. PCR-primere er anført i tabel 1.
- Inducer Cre-Lox-rekombination ved tamoxifeninjektion ved 1 mg/dag i.p. i 5 dage i 6 uger gammel MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- og MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- hanmus.
- Inducer aterosklerose ved at placere 8 uger gamle hanmus (2 uger efter tamoxifenbehandling) på en HCHF-diæt (40% kcal fedt, 1,25% kolesterol, 0% cholsyre) i 16 uger.
3. Reagenser og dissektionsværktøjsforberedelse
- Lagerolie Red O-opløsningspræparat: Opløs 1 g olie rød O i 100 ml isopropylalkohol.
- Arbejdsolie Rød O-opløsningsforberedelse: Bland 24 ml lager Olie Rød O-opløsning med 16 ml dH2O. Filtrer den fortyndede olie Rød O med 0,45 μm sterile sprøjtefiltre (opløsningen er kun god i 1-2 timer).
- 60% isopropylalkoholpræparat: Bland 60 ml isopropylalkohol med 40 ml dH2O.
- 4% formaldehyd i 1x DPBS-præparat: Fortynd 10 ml 16% formaldehyd i 30 ml 1x DPBS.
- Rengør alle dissektionsværktøjer med 70% ethanol (figur 1).
4. Aktiv dødshjælp (figur 2A)
- Mål musens vægt før aktiv dødshjælp.
- Afliv musen ved intraperitoneal injektion af ketamin og xylazin (hver milliliter indeholder 10 mg/ml ketamin og 2 mg/ml xylazin).
- Placer musen i liggende stilling (maven med forsiden nedad).
5. Åbning af bryst- og bughule og hjerteperfusion (figur 2B)
- Forbered en 10 ml sprøjte med 10 ml 1x DPBS. Hætte med en 25 G nål. Sprøjten vil blive brugt til at skylle hjertet.
- Hold huden op med en pincet (Style 5) og klip med en fin saks fra bunden af maven til toppen af nakken.
- Åbn abdominalvæggen under brystkassen.
- Løft brystbenet med en pincet (Style 5), og skær membranen over, og skær derefter brystkassen væk for at udsætte brysthulen.
- Lav et lille snit i hjertets højre atrium.
- Perfuse gennem den apikale venstre ventrikulære punktering ved langsomt at injicere 10 ml 1x DPBS. Når de er grundigt perfuseret, bliver leveren og nyrerne lysebrune i farven.
- Rengør brysthulen for fremmed blod og væske ved hjælp af en ikke-vævet svamp til at absorbere materialet.
6. Isolering af aorta og grene (figur 2C)
- Fjern organer (dvs. lunge, lever, milt og gastrointestinale og reproduktive organer) og skær kravebenet ved hjælp af pincet (stil 5) og fin saks, mens du lader hjertet, nyrerne og aorta være intakte på stedet.
BEMÆRK: Sørg for ikke at snøre hjertet eller større blodkar. - Placer musen under et stereomikroskop.
- Dissekere aorta og aorta grene, herunder brachiocephalic arterie, halspulsårer, subklave arterier, nyrearterier, almindelige iliac arterier og lårbensarterier ved hjælp af pincet (stil 4) og fjeder saks.
BEMÆRK: Dæk aorta med en våd, ikke-vævet svamp for at undgå dehydrering, mens du dissekerer aorta-grenene. - Disseker forsigtigt og fjern adventitial fedt og bindevæv omkring aorta og aorta grene ved hjælp af pincet (Style 4) og fjeder saks.
BEMÆRK: Da betændelse er fremtrædende i aneurismehyperlipidæmimusen, er det svært at fjerne adventitia. Pas på ikke at rive eller hakke aorta og aorta grene. Dette trin kræver øvelse og tålmodighed.
7. Fastgørelse af hjerte og aorta (figur 2D,E)
- Forbered en 10 ml sprøjte med 10 ml 4% formaldehyd i 1x DPBS. Hætte med en 25 G nål.
FORSIGTIG: Formaldehyd er farligt. Læs MSDS, før du arbejder med dette kemikalie. Brug handsker og sikkerhedsbriller og fremstil fortyndingsopløsningerne inde i en stinkhætte.
BEMÆRK: 4% formaldehydopløsning nedbrydes over tid. Det er vigtigt at bruge frisklavet 4% formaldehyd til fiksering. - Fastgør det vaskulære træ gennem apikal venstre ventrikulær punktering ved langsomt at injicere 10 ml 4% formaldehyd.
BEMÆRK: Formaldehydfiksering forstyrrer flere downstream-applikationer, såsom cellekultur, FACS-analyse og enkeltcellet RNA-sekventeringsanalyse. Spring dette trin over, hvis aorta skal bruges til nogen af disse applikationer. - Rengør brysthulen for enhver fremmed væske med en ikke-vævet svamp for at absorbere materialet.
- Adskil hjertet fra aorta ved at holde hjertet med en pincet (Style 4) og bruge mikrodissekerende fjedersaks.
BEMÆRK: For at udføre en face Oil Red O-farvning efter dette trin anbefales det at skære aorta åben in situ i stedet for ex vivo og fortsætte til punkt 8. Dette gør det nemt for en face aorta at ligge fladt. - Isoler og udskyl aorta og dens major fra 1 mm over halspulsåren til enden af lårbensarterien ved hjælp af pincet (stil 4) og fjedersaks.
- Overfør beholderen til en vokspetriskål eller et 1,5 ml mikrocentrifugerør og fyld med 1x DPBS, indtil den dækker aorta.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
8. Olierød O farvning og billeddannelse af uåbnet hel aorta (figur 3)
- Fastgør beholderen på en vokspetriskål ved hjælp af små stifter (figur 3A).
- Skyl beholderen en gang med 1x DPBS.
- Hæld 25 ml frisk olierød O-opløsning i petriskålen (figur 3B).
BEMÆRK: (1) Isopropanol er farligt og en brandfarlig væske. Brug korrekt personligt beskyttelsesudstyr. (2) Olierød O-opløsning kan let udfældes. De udfældede partikler kan forstyrre efterfølgende farvning. Det er vigtigt at fjerne bundfaldet ved at filtrere Oil Red O-opløsningen gennem et 0,45 μm filter før brug. (3) Det er bedst at tilberede frisk Oil Red O-opløsning og kassere enhver ubrugt opløsning. (4) Ud over OlieRød O er Sudan IV en anden kemisk forbindelse, der anvendes til farvning af lipider, triglycerider og lipoproteiner. Olierød O har dog gradvist erstattet Sudan IV, fordi den røde farve produceret af OlieRød O er mere intens og dermed kan gøre fedt meget lettere at se. - Pletter aorta i 60 minutter ved stuetemperatur (RT). Olie Red O vil plette lipidrig plak rød, hvilket efterlader andre ikke-plakholdige områder blege i farven.
- Vask en gang i 20 minutter med 60% isopropanol ved RT.
BEMÆRK: Overskylning kan afholde plakken. - Skyl aorta 3x med dH2O i 5 minutter for at fjerne isopropanol.
- Under et stereomikroskop skal du forsigtigt rengøre alt perivaskulært fedtvæv omkring aorta ved hjælp af pincet (stil 4) og fjedersaks (figur 3C, D).
BEMÆRK: Det er vigtigt at rengøre alt perivaskulært fedtvæv omkring aorta og dets grene efter farvning, fordi olierødt O-farvet perivaskulært fedtvæv kan give falsk baggrund og forstyrre plakmorfometri og kvantificering af plakområdet. Sørg for ikke at fjerne en del af aortavæggen. Fyld voksskålen med dH2O, indtil den dækker den farvede aorta under rengøringen. Dette trin kræver øvelse og tålmodighed. - Overfør beholderen til et rent glasmikroskop dias.
- Erhverv digitale mikrografer ved hjælp af et kamera, der er tilsluttet et lysmikroskop. Gem billeder i høj opløsning, helst i tagget billedfilformat (TIFF) (figur 3E).
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. For at forhindre, at aorta tørrer, overføres beholderen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og fyldes med 1x DPBS, indtil den dækker aorta. Opbevares ved 4 °C.
9. En face aorta montering (figur 4, figur 5)
- Overfør beholderen til en voks petriskål og fyld med 1x DPBS, indtil den dækker aorta.
- Afse bjant, subklave arterier i aortabuen og iliacarterierne i abdominal aorta 1-2 mm efter bifurkationer. Afskær nyrearterierne. (Figur 4A)
- Langsgående skær aorta-præparatet op langs den indre krumning (figur 4B1) og alene iliacarterier (figur 4B2) med mikrodissekerende fjedersaks.
- Skær de tre grene af aortabuen op (dvs. innominate, venstre fælles carotis, venstre subklave arterie) langs den større krumning indtil basisniveauet for indre krumning (x-mærke) (figur 4B3-B8) med mikrodissekerende fjedersaks.
- Fastgør aorta flad (lumen med forsiden nedad) i et voksfad med små stifter, og påfør 1x DPBS, indtil det dækker aorta for at forhindre det i at tørre (figur 4C).
BEMÆRK: (1) Det er vigtigt at gøre den sammenrullede aorta flad og fastgøre den med ansigtet uden at strække sig. Dette trin vil tage et par dage afhængigt af sværhedsgraden af aterosklerose. (2) For aortas fra Apoe-/- eller Ldlr-/- dyr anbefales det at fastgøre aorta-fladen i 24 timer. (3) Protokollen kan sættes på pause her. - Rengør glasmikroskopets dias med 70% ethanol og sarte opgaveviskere (figur 5A).
- Overfør aorta til et rent glasmikroskop dias og læg 15 dråber optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse på et andet rent glas mikroskop dias (figur 5B).
- Placer forsigtigt glasmikroskopet glide med OCT-forbindelse over aorta og undgå at fange luftbobler på diaset (figur 5C).
- Mærk lysbillederne med eksempelnavne (figur 5D).
BEMÆRK: De monterede en-face aorta-dias kan opbevares i fugtkammeret ved 4 °C i flere måneder.
10. Billeddannelse og læsionskvantificering af en face aorta (figur 6)
- Erhverv digitale mikrografer ved hjælp af et kamera, der er tilsluttet et lysmikroskop. Gem billeder i høj opløsning, helst i tagget billedfilformat (TIFF) (figur 6A).
- Overfør billeder af en ansigt farvet hele aorta til en computer udstyret med ImageJ-software.
- I ImageJ skal du vælge værktøjet "Frihåndsvalg" og cirkulere alle olierøde O-farvede plak manuelt (intense røde pletter), mens du trykker på "Alt" -tasten (til Windows PC) eller "Shift" -tasten (til Mac). Klik derefter på "Mål" i menuen "Analyser" for at få vist læsionsområder i resultatvinduet (figur 6B til venstre).
BEMÆRK: Der er flere faldgruber ved kvantificeringen af aterosklerotiske læsioner: (1) eventuelle små stykker farvet adventitialfedt, der forblev fastgjort til aorta fra trin 8.7, kan give falsk baggrund og forstyrre plaquekvantificering; 2) fjernelse af en del af aortavæggen eller beskadigelse af aorta fra trin 6.4 og 8.7 kan forstyrre kvantificeringen af plak (3) bobler og folder dannet i aorta efter montering (trin 9.8) kan forstyrre kvantificering af plak; og (4) aterosklerotisk plak er et 3D-fænomen, og målinger udført i et 2D-plan afspejler muligvis ikke plakkens sande omfang. Ud over analyse af en face aorta plaque-området anbefales det at analysere plakstørrelsen i aortaroten, brachiocephalic arterien, stigende aorta og abdominal aorta separat8. - Cirkel den ydre kantlinje af aorta og klik på "Mål" i menuen "Analyser" for at få vist aorta-området i resultatvinduet (figur 6B til højre).
- Eksporter alle målinger til en Excel-fil.
- Beregn forholdet mellem plakareal fra det samlede aorta-areal, og normaliser værdien som procentdelen af det samlede olierøde O-overfladeareal.
- Beregn forholdet mellem plakareal i 8-10 Apoe-/- og 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe-mus. Præsenter dataene som gennemsnitlige ± SEM (figur 6C).
- Udfør en uparret studerendes t-test til statistisk analyse af forholdet mellem plakområdedata sammenlignet med en anden musegruppe. Betragt forskellene i gennemsnitsværdier som signifikante ved p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol blev aterosklerotiske læsioner i TGFβR2iSMC-Apoe-mus analyseret efter 4 måneder på en HCHF-diæt7. Ud over omfattende aterosklerose udviklede disse mus både thorax- og abdominal aortaaneurismer, som tidligere rapporteret. Sammenlignet med Apoe-/- mus viste TGFβR2iSMC-Apoe-mus aortavægge alvorlig aterosklerose, hvilket gjorde det vanskeligt at dissekere læsionerne (figur 2C,D,E). Derudover er aneurismerne særligt omfattende under den suprarenale aorta, der minder meget om avancerede humane aortaaneurismer.
Et repræsentativt uåbnet aorta Oil Red O-farvningsbillede fra HCHFD-fodret TGFβR2iSMC-Apoe-mus er vist i figur 3E. Billedet viser en TGFβR2iSMC-Apoe-mus, der udviklede både stigende og abdominal aortaaneurisme, og den viser accelereret aterosklerotisk læsionsdannelse i aorta-grene (her brachiocephalic arterie, halspulsåre, subklave arterier, iliacarterier, lårbensarterier og nyrearterier).
Figur 6A viser en face Oil Red O-farvningsbilledet af Apoe-/- og TGFβR2iSMC-Apoe-mus. Sammenlignet med Apoe-/- gruppen udviste TGFβR2iSMC-Apoe-mus alvorlig aneurismal udvidelse og markeret forlængelse af hele aorta.
Figur 1: Dissektionsværktøjer, der anvendes i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trin-for-trin protokol til udskæring af aorta fra mus på HCHF-diæt.
Dette er fra en 24-ugers gammel TGFβR2iSMC-Apoe mus fodret i 4 måneder på en højt kolesterol højt fedtindhold (HCHF) diæt. (A) Mus under ketamin / xylenbedøvelse. Stiplede linjer angiver, hvor huden skal skæres. (B) Dissektion af musen for at udsætte bryst- og bughulen. (C) Omhyggelig fjernelse af de indre organer (dvs. lunge-, lever-, milt- og mave-tarm- og reproduktive organer) efterfulgt af eksponering af musens aorta under et dissektionsmikroskop. D) Forsigtig fjernelse af bindevævet langs aorta så rent som muligt. (E) Billede af den isolerede hele aorta med grene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Trin-for-trin protokol til uåbnet aorta Oil Red O farvning og billeddannelse.
(A) Fastgørelse af hele aorta med grene på en vokspetriskål. (B) Tildækning af aorta med olierød O-farvningsopløsning. (C) Illustration af hele aorta efter farvning af olierød O. (D) Illustration af olierød O-farvet hel aorta efter rengøring. (E) Repræsentative fotomikrografer af olierøde o-farvede hele aorta af TGFβR2iSMC-Apoe-mus efter 4 måneder på en HCHF-diæt. a) Billede med høj forstørrelse af stigende aorta fra (a) og (b') billede med høj forstørrelse af abdominal aorta fra (b). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Trin-for-trin protokol til en ansigt aorta forberedelse.
(A,B) Det arterielle træ farvet med olierød O åbnes i længderetningen for at flade aorta til billeddannelse. Prikkede linjer langs fartøjets væg og tal angiver sekventielle snit, der er lavet for at åbne karrene. (C) Langsgående opdelt og fastgjort hel aorta på en voks petriskål i en Y-form. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Trin-for-trin protokol til en face aorta montering.
(A) Skånsom rengøring af glasmikroskopet glider med 70% ethanol og tørring med rene laboratorieservietter. (B) Påføring af OCT-forbindelse på overfladen af et glasmikroskop dias, derefter spredning af en face aorta fladt på det andet glasmikroskop dias. (C) Skånsom placering af glasmikroskopets dias med OCT-forbindelse oven på en face aorta prøven. (D) Mærkning af diaset med prøvenavnet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Trin-for-trin protokol til en face aorta billeddannelse og aterosklerotisk læsion kvantificering.
(A) Mikrofotografier af en ansigtsaortas fra Apoe-/- og TGFβR2iSMC-Apoe-mus efter 4 måneder på en HCHF-diæt og farvet med Olierød O. (B) Billeder, der illustrerer processen til computerassisteret kvantificering af aterosklerotiske læsioner. C) Kvantificering af læsionsområdet: % læsionsareal henviser til olierød O-farvet som en % af den samlede aortaoverflade. Alle data, der vises som gennemsnitlige ± SEM (***p < 0,001; uparret tohalet studerendes t-test; n = 9 for Apoe-/- mus og n = 9 for TGFβR2iSMC-Apoe-mus). Klik her for at se en større version af denne figur.
| MYH11-CreERT2 | 5'-TGA CCC CAT CTC TTC ACT CC-3' | |
| 5'-AAC TCC ACG ACC ACC TCA TC-3' | ||
| 5'-AGT CCC TCA CAT CCT CAG GTT-3' | ||
| Tgfbr2fl/fl | 5'-TAA ACA AGG TCC GGA GCC CA-3' | |
| 5'-ACT TCT GCA AGA GGT CCC CT-3' | ||
| Apoe | 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3' | |
| 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3' | ||
| 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3' | ||
Tabel 1: Genodypingprimere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) og lipoproteinreceptor med lav densitet (Ldlr) mangelfulde mus er nyttige til at studere udvikling og behandling af aterosklerose. Efterforskere kan evaluere virkningen af genetik og terapeutiske manipulationer på aterosklerose-relaterede sygdomme initiering, progression og regression ved hjælp af Oil Red O farvning af hele aorta9. Aorta Oil Red O farvning og læsionskvantificering er guldstandardendepunktet for ateroskleroseforskning. Denne teknik er billig og kræver ikke specielt udstyr10. Det er dog ikke let at opnå olierødt O-farvet væv af høj kvalitet. Baseret på tidligere erfaringer er der tre kritiske trin i denne protokol, og hele proceduren kræver øvelse og tålmodighed. Det første kritiske skridt er evnen til at dissekere, fjerne og rense alt perivaskulært fedtvæv omkring aorta og dets grene før og efter olierød O-farvning (figur 2D, figur 3C, D). Det andet nøgletrin er fremstillingen af frisklavet og filtreret Olie Rød O-opløsning. Endelig er det vigtigt, at en face aorta ligger fladt på en voksskål, inden den monteres på glasmikroskopets dias (figur 4C, figur 5B,C).
I sammenligning med andre Oil Red O-farvningsprotokoller giver denne metode kvalitative og kvantitative vurderinger af lipidbelastede plaques i den uåbnede aorta og en face aorta fra en enkelt mus. Den indledende kvalitative vurdering af den uåbnede OlieRød O-farvning giver en generel ide om plakfordelingen og plakstørrelsen i aorta samt alle grene før kvantificering af en face aorta. Undersøgelsens begrænsninger er, at (1) 2D-sammenligning og analyse af 3D-aterosklerotiske plaques ikke afspejler det sande omfang af aterosklerotiske plakvolumener, (2) aterosklerotisk læsionskvantificering er tidskrævende, og (3) det kræver dyreofring.
Efter at aorta er isoleret med succes, kan den bruges til en lang række assays til molekylære undersøgelser. For eksempel kan den bruges til biomekaniske undersøgelser og histologisk analyse til at karakterisere reginal aorta morfologi11. Derudover kan brugerne isolere endotelceller og glatte muskelceller fra friskisoleret hel aorta til cellekultur, FACS-analyse og enkeltcellet RNA-sekventeringsanalyse. Sammenfattende giver denne protokol en trinvis procedure til analyse af aterosklerotisk byrde hos mus. Efterforskere kan bruge denne protokol til at sammenligne aterosklerotisk læsionsoverflod, placering og størrelse mellem dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af et Joint Biology Consortium Microgrant ydet under NIH-tilskud P30AR070253 (P.-Y.C.) og HL135582 (M.S.). Vi er taknemmelige for R. Webber og L. Coon for at opretholde de mus, der blev brugt i denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J.
- Emini Veseli, B., et al.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
