Summary
이 프로토콜은 마우스에서 죽상경화성 부담을 분석하기 위한 단계별 절차를 제공한다. 연구자는이 프로토콜을 사용하여 다른 동물에서 죽상 경화성 병변의 풍부도, 위치 및 크기를 비교할 수 있습니다.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe)- 또는 저밀도 지단백 수용체 (Ldlr)-결핍 고지혈증 마우스는 죽상동맥경화증 연구에 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 모델이다. 그들은 죽상 경화성 병변 형성에 대한 다양한 유전 적 요인과 다양한 세포 유형의 영향을 연구하고 새로운 치료법의 개발을 테스트하는 데 사용됩니다. 단리, 전체 대동맥의 절제, 및 Oil Red O 염색된 죽상경화성 병변의 정량화는 죽상경화성 부담을 평가하기 위해 사용되는 기본적인 형태학적 방법 이다. 이 프로토콜의 목표는 Oil Red O로 마우스 대동맥에서 죽상 경화성 병변을 해부, 퍼퓨즈 고정, 분리, 염색, 이미지 및 분석하기 위해 최적화 된 단계별 수술 방법을 설명하는 것입니다. 무신동맥경화성 병변은 대동맥 전체 트리의 어느 곳에서나 형성될 수 있기 때문에, 이러한 전체 대동맥 오일 레드 O 염색 방법은 단일 마우스의 전체 대동맥 및 모든 가지에서 지질이 함유된 플라크를 평가할 수 있는 장점이 있다. Oil Red O 염색 이외에, 신선한 분리된 전체 대동맥은 다양한 시험관내 및 생체내 실험 및 세포 분리에 사용될 수 있다.
Introduction
미국에서 사망의 주요 원인 인 관상 동맥 질환은 일반적으로 동맥 벽 내부에 플라크가 쌓이는 과정 인 죽상 동맥 경화증에 의해 유발됩니다1. 고지혈증이 발생하기 쉬운 Apoe- 및 Ldlr-결핍 마우스는 죽상동맥경화증과 그 합병증 및 치료법 개발의 조사의 중심입니다2,3,4,5. en face aorta로부터의 죽상경화성 병변의 정량화는 상이한 세포 유형에서 유전자 조작의 영향을 평가하기 위한 중요한 종점 분석이다. 또한 죽상 경화성 질환 개시, 진행 및 퇴행에 영향을 미치도록 고안된 새로운 치료법을 연구하는 데 도움이됩니다. 죽상 경화성 병변은 대동맥과 그 가지 (즉, 가슴의 상완골, 경동맥 및 쇄골 하부 동맥뿐만 아니라 횡격막 아래의 신장, 일반적인 장골 및 대퇴골 동맥)6의 어느 곳에서나 형성 될 수 있습니다. 죽상 경화증 부담과 적절한 치료에 대한 포괄적 인 평가는 종종 간과되는 도전 과제 인 다른 위치에서의 질병 부담에 대한 평가가 필요합니다.
이 프로토콜은 열리지 않은 전체 대동맥에서 시작하여 단일 마우스에서 얼굴 준비를 진행하는 죽상 경화성 병변에 대한 포괄적 인 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 개봉되지 않은 전체 대동맥 Oil Red O 염색은 전체 대동맥과 그 가지에서 지질이 함유 된 플라크의 신속하고 질적 인 평가를 가능하게하며, 얼굴 준비는 마우스 대동맥의 죽상 경화성 병변 분포에 대한 정량적 평가를 제공합니다.
이 기술은 Apoe-/- 고지혈증 배경 (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; 아포-/-; 이하 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스) 및 littermate Apoe-/- 대조군(MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; 아포-/-; 이하 Apoe-/- 마우스라고 함). 동물들은 연구 자료로서 고콜레스테롤 고지방 식단(HCHFD)에 16주 동안 보관된다7. 연구 종료시, 미개봉 전체 대동맥은 지질이 함유 된 플라크의 질적 평가를 위해 Oil Red O로 염색되고 (모든 주요 가지 포함) 이미지화됩니다. 대동맥은 얼굴 준비를 통해 절단되어 열리고, 모든 죽상 경화성 병변은 이미지화되고 정량화됩니다. 이 프로토콜은 Apoe-/- 또는 Ldlr-/- 고지혈증 마우스 모델에서 죽상경화성 병변 발달을 연구하는데 사용될 수 있고 일반적인 대동맥-관련 혈관 생물학 응용에 확장될 수 있다.
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Protocol
mT/mG(재고 번호 007676) 및 Apoe-/-(재고 번호 002052) 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입했습니다. Myh11-CreERT2 마우스는 Stefan Offermanns의 선물이었습니다 (Jackson Laboratory에서 재고 번호 019079로 제공됨). Tgfbr2fl/fl 마우스는 해롤드 L. 모세(밴더빌트 대학교)로부터 수득하였다. 모든 동물 절차는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다.
1. 생쥐
- 생산 MYH11-CreERT2, mT / mGf / f; Apoe-/- 및 MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; 앞서 기술한 바와 같은 Apoe-/- 마우스7. C57BL/6J 배경에 돌연변이 균주를 10세대 이상 번식시킨다.
참고 : Myh11-CreERT2 Cre 마우스 라인은 혈관 항상성 및 혈관 병리학에서 평활근 세포의 역할을 연구하기위한 강력한 도구를 제공합니다. Cre 대립유전자가 Y 염색체 내로 삽입되고; 따라서 암컷 마우스는이 구조를 표현하지 않습니다.
2. 마우스 유전자형, 타목시펜 유도, 고콜레스테롤 고지방 다이어트 먹이기
- 마우스 귀 DNA 및 PCR 분석을 사용하여 마우스 지노타이핑을 수행합니다. 마우스 귀 DNA는 제조업체의 지침에 따라 혈액 및 조직 DNA 분리 키트 (재료 표)를 사용하여 분리해야합니다. PCR 프라이머는 표 1에 열거되어 있다.
- 6주령 MYH11-CreERT2;mT/mGf/f에서 5일 동안 1mg/일 i.p.에서 타목시펜 주사에 의한 크레록스 재조합을 유도; Apoe-/- 및 MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; 아포 - / - 수컷 마우스.
- 8주령의 수컷 마우스(타목시펜 처리 후 2주)를 HCHF 식이(40% kcal 지방, 1.25% 콜레스테롤, 0% 콜산)에 16주 동안 올려 놓음으로써 죽상동맥경화증을 유도하였다.
3. 시약 및 해부 도구 준비
- 스톡 오일 레드 O 용액 제제: 1 g의 오일 레드 O를 이소프로필 알코올 100 mL에 용해시킨다.
- 작업 오일 레드 O 용액 준비 : 24 mL의 원시 오일 레드 O 용액과 16 mL의 dH2O를 섞으십시오. 희석 된 Oil Red O를 0.45 μm 멸균 주사기 필터로 여과하십시오 (용액은 1-2 시간에만 좋습니다).
- 60% 이소프로필 알코올 준비: 이소프로필 알코올 60mL와 dH2O 40mL를 섞는다.
- 1x DPBS 제제에서 4% 포름알데히드: 1x DPBS의 30 mL에 16% 포름알데히드 10 mL를 희석한다.
- 모든 해부 도구를 70% 에탄올로 청소합니다(그림 1).
4. 안락사 (그림 2A)
- 안락사 전에 마우스의 체중을 측정하십시오.
- 케타민과 자일라진의 복강 내 주사로 마우스를 안락사시킵니다 (각 밀리리터에는 10mg / mL 케타민과 2mg / mL 자일라진이 포함되어 있음).
- 마우스를 수핀 위치(배꼽 쪽을 향하게 뒤집어)에 놓습니다.
5. 가슴과 복강 및 심장 관류의 개방 (그림 2B)
- 1x DPBS 10 mL가 있는 10 mL 주사기를 제조하였다. 25G 바늘로 뚜껑을 덮으십시오. 주사기는 심장을 플러시하는 데 사용됩니다.
- 핀셋 (스타일 5)으로 피부를 잡고 복부 바닥에서 목 꼭대기까지 미세한 가위로 자릅니다.
- 흉곽 아래의 복벽을 엽니 다.
- 족집게로 흉골을 들어 올리고 (스타일 5) 횡격막을 자른 다음 흉곽을 잘라 흉강을 노출시킵니다.
- 심장의 오른쪽 심방에 작은 절개를하십시오.
- 정점 좌심실 천자를 통해 관류시켜 1x DPBS 10mL를 천천히 주입한다. 일단 완전히 관류되면 간과 신장은 밝은 갈색이됩니다.
- 재료를 흡수하기 위해 부직포 스폰지를 사용하여 외래 혈액과 액체의 흉강을 청소하십시오.
6. 대동맥과 가지의 분리 (그림 2C)
- 장기 (즉, 폐, 간, 비장, 위장 및 생식 기관)를 제거하고 핀셋 (스타일 5)과 미세한 가위를 사용하여 쇄골을 자르고 심장, 신장 및 대동맥을 그대로 두십시오.
참고 : 심장이나 주요 혈관을 끈으로 묶지 않도록하십시오. - 마우스를 입체 현미경 아래에 놓습니다.
- 족집게(스타일 4)와 봄 가위를 사용하여 상완 동맥, 경동맥, 쇄골 하부 동맥, 신장 동맥, 일반적인 장골 동맥 및 대퇴 동맥을 포함한 대동맥과 대동맥을 해부합니다.
참고 : 대동맥 가지를 해부하는 동안 탈수를 피하기 위해 젖은 부직포 스폰지로 대동맥을 덮으십시오. - 핀셋 (스타일 4)과 스프링 가위를 사용하여 대동맥과 대동맥 가지 주변의 모험 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 해부하고 제거하십시오.
참고 : 염증은 동맥류 고지혈증 마우스에서 두드러지기 때문에 재관을 제거하기가 어렵습니다. 대동맥과 대동맥 가지를 찢거나 닉하지 않도록주의하십시오. 이 단계는 연습과 인내가 필요합니다.
7. 심장과 대동맥의 고정 (그림 2D, E)
- DPBS의 1x 중의 4% 포름알데히드 10 mL와 함께 10 mL 주사기를 제조하였다. 25G 바늘로 뚜껑을 덮으십시오.
주의: 포름알데히드는 위험합니다. 이 화학 물질로 작업하기 전에 MSDS를 읽으십시오. 장갑과 안전 안경을 착용하고 흄 후드 안에 희석액을 생산하십시오.
참고: 4% 포름알데히드 용액은 시간이 지남에 따라 분해됩니다. 고정을 위해 갓 만든 4 % 포름 알데히드를 사용하는 것이 중요합니다. - 4% 포름알데히드 10mL를 천천히 주입하여 정점 좌심실 구멍을 통해 혈관 트리를 고정시킵니다.
참고: 포름알데히드 고정은 세포 배양, FACS 분석 및 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석과 같은 여러 다운스트림 적용을 방해합니다. 대동맥이 이러한 응용 프로그램에 사용될 경우 이 단계를 건너뜁니다. - 재료를 흡수하기 위해 부직포 스폰지로 외래 유체의 흉강을 청소하십시오.
- 핀셋 (스타일 4)으로 심장을 잡고 마이크로 해부 스프링 가위를 사용하여 대동맥에서 심장을 분리하십시오.
참고: 이 단계 후에 엔페이스 오일 레드 O 염색을 수행하려면, 대동맥을 생체외 대신 계내에서 개방하여 절단하고 섹션 8로 진행하는 것이 좋습니다. 이렇게하면 얼굴 대동맥이 평평하게 놓이기 쉽습니다. - 핀셋 (스타일 4)과 스프링 가위를 사용하여 대동맥 위 1mm에서 대퇴 동맥 끝까지 대동맥과 그 전공을 분리하고 소비하십시오.
- 용기를 왁스 페트리 접시 또는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 대동맥을 덮을 때까지 1x DPBS로 채 웁니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
8. Oil Red O 염색 및 개봉되지 않은 전체 대동맥의 이미징 (그림 3)
- 미누티엔 핀을 사용하여 왁스 페트리 접시에 용기를 고정시킵니다(그림 3A).
- 1x DPBS로 혈관을 한 번 헹구십시오.
- 신선한 Oil Red O 용액 25mL를 페트리 접시에 붓습니다(그림 3B).
참고 : (1) 이소프로판올은 위험하고 가연성 액체입니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오. (2) Oil Red O 용액은 쉽게 침전 될 수 있습니다. 침전된 입자는 후속 염색을 방해할 수 있다. 사용 전에 Oil Red O 용액을 0.45 μm 필터를 통해 여과하여 침전물을 제거하는 것이 중요합니다. (3) 신선한 Oil Red O 용액을 준비하고 사용하지 않은 용액을 버리는 것이 가장 좋습니다. (4) Oil Red O 외에도 수단 IV는 지질, 트리글리세리드 및 지단백질의 염색에 사용되는 또 다른 화학 화합물입니다. 그러나 Oil Red O는 Oil Red O에 의해 생성 된 적색이 더 강렬하여 지방을 훨씬 쉽게 볼 수 있기 때문에 수단 IV를 점차 대체했습니다. - 대동맥을 실온에서 60 분 동안 얼룩 지게하십시오 (RT). Oil Red O는 지질이 풍부한 플라크를 빨간색으로 염색하여 다른 비 플라크를 포함하는 영역을 옅은 색으로 남깁니다.
- RT에서 60% 이소프로판올로 20분 동안 한 번 씻으십시오.
참고 : 과도한 헹굼은 플라크를 얼룩지게 할 수 있습니다. - 대동맥을 5분 동안 dH2O로 3x 헹구어 이소프로판올을 제거하였다.
- 입체 현미경으로 핀셋(스타일 4)과 스프링 가위(그림 3C,D)를 사용하여 대동맥 주변의 모든 혈관 주위 지방 조직을 부드럽게 청소합니다.
참고 : Oil Red O로 염색 된 혈관 주위 지방 조직은 잘못된 배경을 생성하고 플라크 형태 측정 및 플라크 면적 정량화를 방해 할 수 있기 때문에 염색 후 대동맥 주변의 모든 혈관 주위 지방 조직을 청소하는 것이 중요합니다. 대동맥 벽의 일부를 제거하지 않도록하십시오. 세척하는 동안 얼룩진 대동맥을 덮을 때까지 왁스 접시를 dH2O로 채 웁스 접시를 채 웁스 접시를 채 웁니다. 이 단계는 연습과 인내가 필요합니다. - 용기를 깨끗한 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다.
- 광학 현미경에 연결된 카메라를 사용하여 디지털 현미경을 획득합니다. 고해상도 이미지를 태그가 지정된 이미지 파일 형식(TIFF)으로 저장하는 것이 좋습니다(그림 3E).
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 대동맥이 건조되는 것을 방지하려면 용기를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 대동맥을 덮을 때까지 1x DPBS로 채 웁니다. 4°C에서 보관한다.
9. En 얼굴 대동맥 장착 (그림 4, 그림 5)
- 용기를 왁스 페트리 접시로 옮기고 대동맥을 덮을 때까지 1x DPBS로 채 웁니다.
- 분기 후 복부 대동맥의 대동맥과 장골 동맥의 경동맥, 쇄골 하부 동맥을 1-2mm 절단하십시오. 신장 동맥을 절단하십시오. (그림 4A)
- 세로 절단하여 미세 해부 스프링 가위로 내부 곡률 (그림 4B1) 및 단독으로 장골 동맥 (그림 4B2)을 따라 대동맥 제제를 엽니 다.
- 미세 해부 스프링 가위로 내부 곡률 (x-mark) (그림 4B3-B8)의 기본 레벨까지 더 큰 곡률을 따라 대동맥 아치의 세 가지 (즉, 무명, 왼쪽 일반적인 경동맥, 왼쪽 쇄골 하부 동맥)를 엽니 다.
- 대동맥 플랫(루멘 사이드 페이스업)을 미뉴티엔 핀이 있는 왁스 접시에 고정하고 대동맥을 덮을 때까지 DPBS를 1x 발라서 건조되지 않도록 합니다(그림 4C).
참고 : (1) 롤업 대동맥을 평평하게 만들고 스트레칭하지 않고 얼굴에 고정하는 것이 중요합니다. 이 단계는 죽상 동맥 경화증의 중증도에 따라 며칠이 걸릴 것입니다. (2) Apoe-/- 또는 Ldlr-/- 동물의 대동맥의 경우 대동맥을 24시간 동안 고정하는 것이 좋습니다. (3) 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 유리 현미경 슬라이드를 70% 에탄올과 섬세한 작업 와이퍼로 청소합니다(그림 5A).
- 대동맥을 깨끗한 유리 현미경 슬라이드로 옮기고 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물 15 방울을 다른 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 넣습니다 (그림 5B).
- OCT 화합물이 있는 유리 현미경 슬라이드를 대동맥 위에 조심스럽게 놓고 슬라이드에 기포가 끼워지지 않도록 합니다(그림 5C).
- 슬라이드에 샘플 이름으로 레이블을 지정합니다(그림 5D).
참고: 장착된 en face 대동맥 슬라이드는 수개월 동안 4°C의 수분 챔버에 보관할 수 있습니다.
10. 얼굴 대동맥의 영상 및 병변 정량화(그림 6)
- 광학 현미경에 연결된 카메라를 사용하여 디지털 현미경을 획득합니다. 고해상도 이미지를 태그가 지정된 이미지 파일 형식(TIFF)으로 저장하는 것이 좋습니다(그림 6A).
- 얼굴 전체에 얼룩진 대동맥의 이미지를 ImageJ 소프트웨어가 장착 된 컴퓨터로 전송하십시오.
- ImageJ에서 "자유형 선택"도구를 선택하고 "Alt"키 (Windows PC의 경우) 또는 "Shift"키 (Mac의 경우)를 누르면서 모든 Oil Red O 염색 플라크를 수동으로 동그라미로 돌립니다 (강렬한 빨간색 반점). 그런 다음 "분석" 메뉴에서 "측정"을 클릭하여 결과 창에 병변 영역을 표시합니다(그림 6B 왼쪽).
참고 : 죽상 경화성 병변의 정량화에는 몇 가지 함정이 있습니다 : (1) 8.7 단계에서 대동맥에 부착 된 염색 된 모험 지방의 작은 조각은 잘못된 배경을 생성하고 플라크 정량화를 방해 할 수 있습니다. (2) 단계 6.4 및 8.7로부터 대동맥벽의 일부를 제거하거나 대동맥을 손상시켜 플라크 정량화를 방해할 수 있고; (3) 장착 후(단계 9.8) 대동맥에 형성된 기포 및 주름이 플라크 정량을 방해할 수 있고; (4) 죽상 경화성 플라크는 3D 현상이며, 2D 평면에서 수행 된 측정은 플라크의 실제 정도를 반영하지 않을 수 있습니다. en face aorta plaque area의 분석 외에도, 대동맥 뿌리, 상완 동맥, 오름차순 대동맥 및 복부 대동맥의 플라크 크기를 별도로 분석하는 것이 좋습니다8. - 대동맥의 외부 경계선을 원으로 돌리고 "분석" 메뉴에서 "측정"을 클릭하여 결과 창에 대동맥 영역을 표시합니다(그림 6B 오른쪽).
- 모든 측정값을 Excel 파일로 내보냅니다.
- 전체 대동맥 면적에서 플라크 면적의 비율을 계산하고 값을 총 Oil Red O 표면적의 백분율로 정규화하십시오.
- 8-10 Apoe-/- 및 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스의 플라크 면적 비율을 계산합니다. 데이터를 SEM에 대한 평균 ± 제시합니다(도 6C).
- 다른 마우스 그룹과 비교한 플라크 면적 데이터의 비율에 대한 통계적 분석을 위해 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 수행합니다. 평균값의 차이를 p < 0.05에서 유의한 것으로 간주하십시오.
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Representative Results
이 프로토콜에서, TGFβR2iSMC-Apoe 마우스의 죽상경화성 병변을 HCHF 식이7 상에서 4개월 후에 분석하였다. 광범위한 죽상 동맥 경화증 외에도,이 마우스는 이전에 보도 된 바와 같이 흉부 및 복부 대동맥류를 개발했습니다. Apoe-/- 마우스와 비교했을 때, TGFβR2iSMC-Apoe 마우스 대동맥벽은 심각한 죽상동맥경화증을 나타내어 병변을 해부하기 어렵게 만들었다(그림 2C,D,E). 또한, 동맥류는 특히 suprarenal 대동맥 아래에 광범위하며, 진행된 인간 대동맥류를 연상케합니다.
HCHFD 공급 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스로부터의 대표적인 미개봉 대동맥 오일 레드 O 염색 이미지를 도 3E에 나타내었다. 이미지는 오름차순 및 복부 대동맥류를 모두 발달시킨 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스를 보여주며, 대동맥 가지(여기서, 상완 동맥, 경동맥, 쇄골하 동맥, 장골 동맥, 대퇴골 동맥 및 신장 동맥)에서 가속화된 죽상경화성 병변 형성을 보여준다.
도 6A는 Apoe-/- 및 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스의 엔페이스 오일 레드 O 염색 이미지를 도시한다. Apoe-/- 그룹과 비교하여, TGFβR2iSMC-Apoe 마우스는 심한 동맥류 확대 및 전체 대동맥의 현저한 신장을 나타냈다.
그림 1: 프로토콜에 사용되는 해부 도구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : HCHF 식단에서 마우스에서 대동맥을 절제하기위한 단계별 프로토콜.
이것은 고콜레스테롤 고지방 (HCHF) 식단으로 4 개월 동안 먹인 24 주 된 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스에서 나온 것입니다. (A) 케타민 / 자일렌 마취 하의 마우스. 파선은 피부를 자르는 위치를 나타냅니다. (B) 흉부 및 복강을 노출시키기 위한 마우스의 해부. (C) 내부 장기(즉, 폐, 간, 비장, 위장 및 생식 기관)를 조심스럽게 제거한 후 해부 현미경으로 마우스 대동맥을 노출시킨다. (D) 대동맥을 따라 결합 조직을 가능한 한 깨끗하게 조심스럽게 제거하십시오. (e) 가지가있는 고립 된 전체 대동맥의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 개봉되지 않은 대동맥 Oil Red O 염색 및 이미징을 위한 단계별 프로토콜.
(A) 왁스 페트리 접시에 가지가있는 대동맥 전체를 고정시킵니다. (b) 대동맥을 Oil Red O 염색 용액으로 덮는다. (c) Oil Red O 염색 후의 대동맥 전체의 그림. (D) 오일 레드 O 염색 후 전체 대동맥의 그림. (e) HCHF 식이에서 4개월 후 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스의 전체 대동맥을 염색한 Oil Red O의 대표적인 현미경 사진. (a') (a)로부터 오름차순 대동맥의 고배율 이미지 및 (b')로부터의 복부 대동맥의 고배율 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 앙페이스 대동맥 제제를 위한 단계별 프로토콜.
(A, B) Oil Red O로 염색 된 동맥 나무는 이미징을 위해 대동맥을 평평하게하기 위해 세로 방향으로 열립니다. 선박 벽을 따라 점선과 숫자는 선박을 열기 위해 만들어진 순차적 인 절단을 나타냅니다. (C) 전체 대동맥을 세로 분할하여 왁스 페트리 접시에 Y 자형으로 고정시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대면 대동맥 장착을 위한 단계별 프로토콜.
(A) 유리 현미경 슬라이드를 70 % 에탄올로 부드럽게 청소하고 깨끗한 실험실 물티슈로 건조시킵니다. (b) 하나의 유리 현미경 슬라이드의 표면에 OCT 화합물을 도포 한 다음 다른 유리 현미경 슬라이드에 평평한 대동맥을 퍼뜨립니다. (C) en face aorta 샘플의 상부에 OCT 화합물이 있는 유리 현미경 슬라이드의 온화한 배치. (D) 샘플 이름으로 슬라이드의 레이블 지정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: en face aorta imaging 및 atherosclerotic lesion quantification을 위한 단계별 프로토콜.
(A) HCHF 식이요법에서 4개월 후 Apoe-/- 및 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스로부터의 얼굴 대동맥의 현미경 사진 및 Oil Red O.로 염색한 (B) 죽상경화성 병변의 컴퓨터 보조 정량화 과정을 보여주는 이미지. (c) 병변 면적 정량화: % 병변 면적은 전체 대동맥 표면의 %로서 Oil Red O로 염색된 것을 지칭한다. 모든 데이터는 SEM± 평균으로 나타내었다 (***p < 0.001; 짝을 이루지 않은 두 꼬리 스튜던트 t-검정; Apoe-/- 마우스의 경우 n=9, TGFβR2iSMC-Apoe 마우스의 경우 n=9). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| MYH11-CreERT2 | 5'-TGA CCC CAT CTC TTC ACT CC-3' | |
| 5'-AAC TCC ACG ACC ACC TCA TC-3' | ||
| 5'-AGT CCC TCA CAT CCT CAG GTT-3' | ||
| Tgfbr2fl/fl | 5'-TAA ACA AGG TCC GGA GCC CA-3' | |
| 5'-ACT TCT GCA AGA GGT CCC CT-3' | ||
| 아포에 | 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3' | |
| 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3' | ||
| 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3' | ||
표 1: 유전자형 프라이머.
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Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) 및 저밀도 지단백 수용체 (Ldlr) 결핍 마우스는 죽상 동맥 경화증의 개발 및 치료를 연구하는 데 유용합니다. 조사관은 전체 대동맥9의 Oil Red O 염색을 사용하여 죽상동맥경화증 관련 질환 개시, 진행 및 퇴행에 대한 유전학 및 치료 조작의 영향을 평가할 수 있다. 대동맥 오일 레드 O 염색 및 병변 정량화는 죽상 동맥 경화증 연구를위한 황금 표준 종점입니다. 이 기술은 저렴하며 특수 장비가 필요하지 않습니다10. 그러나, 고품질의 Oil Red O 염색 조직을 얻는 것은 쉽지 않습니다. 이전 경험을 바탕으로이 프로토콜에는 세 가지 중요한 단계가 있으며 전체 절차에는 연습과 인내가 필요합니다. 첫 번째 중요한 단계는 Oil Red O 염색 전후에 대동맥 주변의 모든 혈관 주위 지방 조직과 그 가지를 해부, 제거 및 청소하는 능력입니다 (그림 2D, 그림 3C, D). 두 번째 핵심 단계는 갓 만들어지고 여과 된 Oil Red O 용액을 준비하는 것입니다. 마지막으로, 유리 현미경 슬라이드에 장착하기 전에 왁스 접시에 대동맥이 평평하게 놓여 있는 것이 중요합니다(그림 4C, 그림 5B, C).
다른 Oil Red O 염색 프로토콜과 비교하여, 이 방법은 단일 마우스로부터의 미개봉 대동맥 및 안면 대동맥에서 지질이 함유된 플라크의 정성적 및 정량적 평가를 제공한다. 미개봉 Oil Red O 염색의 초기 정성적 평가는 대동맥의 플라크 분포 및 플라크 크기뿐만 아니라 앙페이스 대동맥의 정량화 전의 모든 가지에 대한 일반적인 아이디어를 제공합니다. 연구의 한계는 (1) 3D 죽상 경화성 플라크의 2D 비교 및 분석이 죽상 경화성 플라크 부피의 진정한 정도를 반영하지 않으며, (2) 죽상 경화성 병변 정량화는 시간이 많이 걸리고, (3) 동물 희생이 필요하다는 것입니다.
대동맥이 성공적으로 분리 된 후에는 분자 연구를위한 다양한 분석에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 그것은 reginal 대동맥 형태학을 특성화하기 위해 생체 역학 연구 및 조직 학적 분석에 사용될 수있다11. 또한 사용자는 세포 배양, FACS 분석 및 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석을 위해 새로 분리 된 전체 대동맥에서 내피 세포 및 평활근 세포를 분리 할 수 있습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 마우스에서 죽상경화성 부담을 분석하기 위한 단계별 절차를 제공한다. 연구자는이 프로토콜을 사용하여 죽상 경화성 병변의 풍부도, 위치 및 동물 간의 크기를 비교할 수 있습니다.
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Disclosures
저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 P30AR070253 (P.-Y.C.) 및 HL135582 (M.S.)에 따라 제공되는 공동 생물학 컨소시엄 마이크로 그랜트에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 우리는이 연구에 사용 된 마우스를 유지 한 R. Webber와 L. Coon에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
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- Emini Veseli, B., et al.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
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