Summary
Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure om atherosclerotische belasting bij muizen te analyseren. Onderzoekers kunnen dit protocol gebruiken om de overvloed, locatie en grootte van atherosclerotische laesies bij verschillende dieren te vergelijken.
Abstract
Apolipoproteïne E (Apoe) - of low density lipoprotein receptor (Ldlr) - deficiënte hyperlipidemische muizen zijn de twee meest gebruikte modellen voor atherosclerose onderzoek. Ze worden gebruikt om de impact van verschillende genetische factoren en verschillende celtypen op de vorming van atherosclerotische laesies te bestuderen en om de ontwikkeling van nieuwe therapieën te testen. Isolatie, excisie van de hele aorta en kwantificering van olierode O-gekleurde atherosclerotische laesies zijn basale morfometrische methoden die worden gebruikt om atherosclerotische belasting te evalueren. Het doel van dit protocol is om een geoptimaliseerde, stapsgewijze chirurgische methode te beschrijven om atherosclerotische laesies in muisabortas te ontleden, perfuseren-fixeren, isoleren, kleuren, in beeld te brengen en te analyseren met aorta's van muizen met Oil Red O. Omdat atherosclerotische laesies zich overal in de hele aortaboom kunnen vormen, heeft deze hele aorta Oil Red O-kleuringsmethode het voordeel dat lipide-beladen plaques in de hele aorta en alle takken in een enkele muis worden geëvalueerd. Naast Oil Red O-kleuring kunnen verse geïsoleerde hele aorta's worden gebruikt voor verschillende in vitro en in vivo experimenten en celisolaties.
Introduction
Coronaire hartziekte, een belangrijke doodsoorzaak in de VS, wordt meestal veroorzaakt door atherosclerose, een proces dat leidt tot de opbouw van plaque in arteriële wanden1. Hyperlipidemie-gevoelige Apoe- en Ldlr-deficiënte muizen staan centraal in onderzoek naar atherosclerose en de complicaties ervan en de ontwikkeling van therapieën2,3,4,5. Kwantificering van atherosclerotische laesies van een en face aorta is een belangrijke eindpuntanalyse voor het evalueren van de impact van genetische manipulatie in verschillende celtypen. Het helpt ook om nieuwe therapieën te bestuderen die zijn ontworpen om de initiatie, progressie en regressie van atherosclerotische ziekten te beïnvloeden. Atherosclerotische laesies kunnen zich overal in de aorta en zijn takken vormen (d.w.z. brachiocephalische, carotis- en subclaviaslagaders in de borst, evenals renale, gemeenschappelijke iliacale en femorale slagaders onder het diafragma)6. Een uitgebreide evaluatie van atheroscleroselast en geschikte therapie vereist een beoordeling van de ziektelast op verschillende locaties, een uitdaging die vaak over het hoofd wordt gezien.
Dit protocol beschrijft hoe een uitgebreide analyse van atherosclerotische laesies kan worden uitgevoerd, te beginnen met een ongeopende hele aorta en overgaand tot en face-voorbereiding, in een enkele muis. Ongeopende hele aorta Oil Red O-kleuring maakt een snelle, kwalitatieve beoordeling van met lipiden beladen plaques in de gehele aorta en zijn takken mogelijk, terwijl en face-voorbereiding een kwantitatieve beoordeling biedt van de verdeling van atherosclerotische laesies in de aorta van de muis.
De techniek maakt gebruik van 8 weken oude muizen met een gladde spiercel-specifieke TGFβR2-deletie op de Apoe-/- hyperlipidemische achtergrond (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; hierna TGFβR2iSMC-Apoe-muizen genoemd) en nestgenoot Apoe-/- controles (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; hierna Apoe-/- muizen genoemd). De dieren worden 16 weken lang gehouden op een cholesterolrijk vetrijk dieet (HCHFD) als studiemateriaal7. Aan het einde van het onderzoek worden de ongeopende hele aorta's gekleurd en afgebeeld (inclusief alle belangrijke takken) met Oil Red O voor kwalitatieve beoordeling van met lipiden beladen plaques. De aorta's worden opengesneden via en face preparation en alle atherosclerotische laesies worden in beeld gebracht en gekwantificeerd. Dit protocol kan worden gebruikt om de ontwikkeling van atherosclerotische laesies in Apoe-/- of Ldlr-/- hyperlipidemie muizenmodellen te bestuderen en uitgebreid naar algemene aorta-gerelateerde vasculaire biologietoepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mT/mG (voorraad nr. 007676) en Apoe-/- (voorraad nr. 002052) muizen werden gekocht van het Jackson Laboratory. Myh11-CreERT2 muizen waren een geschenk van Stefan Offermanns (verkrijgbaar bij het Jackson Laboratory als voorraad nr. 019079). Tgfbr2fl/fl muizen werden verkregen van Harold L. Moses (Vanderbilt University). Alle dierprocedures werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Muizen
- Produceer MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- en MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- muizen zoals eerder beschreven7. Ras mutante stammen naar de C57BL /6J achtergrond voor meer dan tien generaties.
OPMERKING: De Myh11-CreERT2 Cre muislijn biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de rol van gladde spiercellen in vasculaire homeostase en vasculaire pathologie. Het Cre-allel wordt ingebracht in het Y-chromosoom; vrouwelijke muizen drukken deze constructie dus niet uit.
2. Muis genotypering, tamoxifen inductie, en hoog cholesterol vet dieet voeding
- Voer muisgenotypering uit met behulp van muisoor-DNA en PCR-analyse. Muisoor-DNA moet worden geïsoleerd met behulp van de DNA-isolatiekit voor bloed en weefsel (Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. PCR-primers zijn vermeld in tabel 1.
- Induceer Cre-Lox recombinatie door tamoxifen injectie bij 1 mg / dag i.p. gedurende 5 dagen in 6 weken oude MYH11-CreERT2; mT / mGf / f; Apoe-/- en MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- mannelijke muizen.
- Induceer atherosclerose door 8 weken oude mannelijke muizen (2 weken na behandeling met tamoxifen) gedurende 16 weken op een HCHF-dieet (40% kcal vet, 1,25% cholesterol, 0% cholzuur) te plaatsen.
3. Voorbereiding van reagentia en dissectiegereedschap
- Stock Oil Red O oplossingspreparaat: los 1 g Oil Red O op in 100 ml isopropylalcohol.
- Working Oil Red O solution preparation: meng 24 ml stock Oil Red O-oplossing met 16 ml dH2O. Filter de verdunde Oil Red O met steriele spuitfilters van 0,45 μm (de oplossing is slechts goed voor 1-2 uur).
- 60% isopropylalcoholpreparaat: meng 60 ml isopropylalcohol met 40 ml dH2O.
- 4% formaldehyde in 1x DPBS-preparaat: verdun 10 ml 16% formaldehyde in 30 ml 1x DPBS.
- Reinig alle dissectiegereedschappen met 70% ethanol (figuur 1).
4. Euthanasie (figuur 2A)
- Meet het gewicht van de muis voorafgaand aan euthanasie.
- Euthanaseer de muis door intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine (elke milliliter bevat 10 mg / ml ketamine en 2 mg / ml xylazine).
- Plaats de muis in rugligging (buikzijde face-up).
5. Opening van borst- en buikholte en hartperfusie (figuur 2B)
- Bereid een spuit van 10 ml voor met 10 ml 1x DPBS. Dop met een naald van 25 G. De spuit zal worden gebruikt om het hart te spoelen.
- Houd de huid omhoog met een pincet (Style 5) en knip met een fijne schaar van de basis van de buik tot aan de bovenkant van de nek.
- Open de buikwand onder de ribbenkast.
- Til het borstbeen op met een pincet (Stijl 5) en snijd het diafragma af en snijd vervolgens de ribbenkast weg om de thoracale holte bloot te leggen.
- Maak een kleine incisie in het rechter atrium van het hart.
- Perfuseer door de apicale linkerventrikelpunctie door langzaam 10 ml 1x DPBS te injecteren. Eenmaal grondig doordrenkt, worden de lever en de nier lichtbruin van kleur.
- Reinig de borstholte van vreemd bloed en vocht door een niet-geweven spons te gebruiken om het materiaal te absorberen.
6. Isolatie van aorta en takken (figuur 2C)
- Verwijder organen (d.w.z. longen, lever, milt en gastro-intestinale en voortplantingsorganen) en knip het sleutelbeen door met een pincet (stijl 5) en een fijne schaar terwijl het hart, de nieren en de aorta intact blijven in situ.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het hart of belangrijke bloedvaten niet scheurt. - Plaats de muis onder een stereomicroscoop.
- Ontleed aorta- en aortatakken, waaronder brachiocephalische slagaders, halsslagaders, subclaviaslagaders, nierslagaders, gemeenschappelijke iliacale slagaders en femorale slagaders met behulp van een pincet (stijl 4) en een lenteschaar.
OPMERKING: Bedek de aorta met een natte, niet-geweven spons om uitdroging te voorkomen tijdens het ontleden van de aortatakken. - Ontleed en verwijder voorzichtig het adipale vet- en bindweefsel rond de aorta- en aortatakken met behulp van een pincet (Style 4) en een veerschaar.
OPMERKING: Omdat ontsteking prominent aanwezig is in de aneurysma hyperlipidemie muis, is het moeilijk om adventitia te verwijderen. Pas op dat u de aorta- en aortatakken niet scheurt of snijdt. Deze stap vereist oefening en geduld.
7. Fixatie van hart en aorta (Figuur 2D,E)
- Bereid een spuit van 10 ml met 10 ml 4% formaldehyde in 1x DPBS. Dop met een naald van 25 G.
LET OP: Formaldehyde is gevaarlijk. Lees het VIB voordat u met deze chemische stof werkt. Draag handschoenen en veiligheidsbrillen en produceer de verdunningsoplossingen in een zuurkast.
OPMERKING: 4% formaldehyde-oplossing wordt na verloop van tijd afgebroken. Het is belangrijk om vers gemaakte 4% formaldehyde te gebruiken voor fixatie. - Fixeer de vasculaire boom door apicale linkerventrikelpunctie door langzaam 10 ml 4% formaldehyde te injecteren.
OPMERKING: Formaldehydefixatie interfereert met verschillende downstream-toepassingen, zoals celcultuur, FACS-analyse en eencellige RNA-sequencinganalyse. Sla deze stap over als de aorta voor een van deze toepassingen wordt gebruikt. - Reinig de borstholte van vreemde vloeistof met een niet-geweven spons om het materiaal te absorberen.
- Scheid het hart van de aorta door het hart vast te houden met een pincet (Style 4) en met een micro-ontleedbare veerschaar.
OPMERKING: Om na deze stap en face Oil Red O-kleuring uit te voeren, wordt aanbevolen om de aorta ter plaatse open te snijden in plaats van ex vivo en door te gaan naar sectie 8. Hierdoor is het gemakkelijk voor de en face aorta om plat te liggen. - Isoleer en snijd de aorta en zijn majeur van 1 mm boven de halsslagader tot het einde van de dijbeenslagader met behulp van een pincet (stijl 4) en een veerschaar.
- Breng het vat over in een was petrischaaltje of 1,5 ml microcentrifugebuis en vul met 1x DPBS totdat het de aorta bedekt.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
8. Olierode O-kleuring en beeldvorming van ongeopende hele aorta (figuur 3)
- Pin het vat op een wassen petrischaaltje met minutienpennen (figuur 3A).
- Spoel het vat eenmaal af met 1x DPBS.
- Giet 25 ml verse Oil Red O-oplossing in de petrischaal (figuur 3B).
OPMERKING: (1) Isopropanol is gevaarlijk en een brandbare vloeistof. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. (2) Olie Red O-oplossing kan gemakkelijk neerslaan. De neergeslagen deeltjes kunnen de daaropvolgende kleuring verstoren. Het is belangrijk om het neerslag te verwijderen door de Oil Red O-oplossing vóór gebruik door een filter van 0,45 μm te filteren. (3) Het is het beste om verse Oil Red O-oplossing te bereiden en alle ongebruikte oplossing weg te gooien. (4) Naast Oil Red O is Sudan IV een andere chemische verbinding die wordt gebruikt voor het kleuren van lipiden, triglyceriden en lipoproteïnen. Oil Red O heeft Soedan IV echter geleidelijk vervangen omdat de rode kleur geproduceerd door Oil Red O intenser is en dus vet veel gemakkelijker te zien kan maken. - Kleur de aorta gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur (RT). Oil Red O zal lipiderijke plaque rood kleuren, waardoor andere niet-plaque bevattende gebieden bleek van kleur blijven.
- Eenmaal gedurende 20 minuten wassen met 60% isopropanol bij RT.
OPMERKING: Overspoelen kan de plaque vasthouden. - Spoel de aorta 3x af met dH2O gedurende 5 minuten om isopropanol te verwijderen.
- Reinig onder een stereomicroscoop voorzichtig al het perivasculaire vetweefsel rond de aorta met een pincet (Stijl 4) en een veerschaar (figuur 3C,D).
OPMERKING: Het is belangrijk om al het perivasculaire vetweefsel rond de aorta en zijn takken na kleuring schoon te maken, omdat olierood O-gekleurd perivasculair vetweefsel een valse achtergrond kan opleveren en kan interfereren met plaquemorfometrie en kwantificering van plaquegebied. Zorg ervoor dat u een deel van de aortawand niet verwijdert. Vul de wasschaal met dH2O totdat deze de bevlekte aorta bedekt tijdens het reinigen. Deze stap vereist oefening en geduld. - Breng het vat over op een schone, glazen microscoopglaasje.
- Verkrijg digitale microfoto's met behulp van een camera die is aangesloten op een lichtmicroscoop. Sla afbeeldingen met een hoge resolutie op, bij voorkeur in TIFF (Tagged Image File Format) (Figuur 3E).
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Om te voorkomen dat de aorta uitdroogt, brengt u het vat over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en vult u met 1x DPBS totdat deze de aorta bedekt. Bewaren bij 4 °C.
9. Montage van aorta aan de voorkant (figuur 4, figuur 5)
- Breng het vat over in een was petrischaaltje en vul met 1x DPBS totdat het de aorta bedekt.
- Snijd de halsslagaders, subclavia van de aortaboog en iliacale slagaders in de abdominale aorta 1-2 mm na bifurcaties. Snijd de nierslagaders af. (Figuur 4A)
- Snijd het aortapreparaat langs de binnenste kromming (figuur 4B1) en alleen iliacale slagaders (figuur 4B2) in de lengterichting open met een micro-ontledende veerschaar.
- Knip de drie takken van de aortaboog (d.w.z. inmerineraat, linker halsslagader, linker subclaviaslagader) open langs de grotere kromming tot het basisniveau van de binnenkromming (x-markering) (figuur 4B3-B8) met micro-ontleedende veerschaar.
- Speld de aorta plat (lumen side face-up) in een wasschaal met minutien pinnen en breng 1x DPBS aan totdat deze de aorta bedekt om te voorkomen dat deze uitdroogt (figuur 4C).
OPMERKING: (1) Het is belangrijk om de opgerolde aorta plat te maken en vast te pinnen in het gezicht zonder uit te rekken. Deze stap duurt een paar dagen, afhankelijk van de ernst van atherosclerose. (2) Voor aorta's van Apoe-/- of Ldlr-/- dieren wordt aanbevolen om de aorta plat te pinnen gedurende 24 uur. (3) Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Reinig de glazen microscoopglaasjes met 70% ethanol en delicate taakwissers (figuur 5A).
- Breng de aorta over in een microscoopglaasje van schoon glas en leg 15 druppels optimale snijtemperatuur (OCT) op een ander schoon glazen microscoopglaasje (figuur 5B).
- Plaats het glazen microscoopglaasje met OCT-verbinding voorzichtig over de aorta en vermijd het vangen van luchtbellen op de dia (figuur 5C).
- Label de dia's met voorbeeldnamen (figuur 5D).
OPMERKING: De gemonteerde en face aorta-dia's kunnen enkele maanden in de vochtkamer bij 4 °C worden bewaard.
10. Beeldvorming en kwantificering van laesies van en face aorta (figuur 6)
- Verkrijg digitale microfoto's met behulp van een camera die is aangesloten op een lichtmicroscoop. Sla afbeeldingen met een hoge resolutie op, bij voorkeur in TIFF (Tagged Image File Format) (Figuur 6A).
- Breng beelden van de met gezicht bevlekte hele aorta over naar een computer die is uitgerust met ImageJ-software.
- Selecteer in ImageJ het gereedschap "Selectie uit de vrije hand" en omcirkel alle olierode O-gekleurde plaque handmatig (intense rode vlekken) terwijl u op de toets "Alt" (voor Windows-pc) of "Shift" (voor Mac) drukt. Klik vervolgens op "Meten" in het menu "Analyseren" om laesiegebieden in het resultatenvenster weer te geven (figuur 6B links).
OPMERKING: Er zijn verschillende valkuilen van de kwantificering van atherosclerotische laesies: (1) kleine stukjes gekleurd adventsvet die vanaf stap 8.7 aan de aorta zijn blijven kleven, kunnen een valse achtergrond opleveren en de kwantificering van plaque verstoren; (2) het verwijderen van een deel van de aortawand of het beschadigen van de aorta uit stap 6.4 en 8.7 kan de kwantificering van plaque verstoren; (3) bellen en plooien gevormd in de aorta na montage (stap 9.8) kunnen de kwantificering van plaque verstoren; en (4) atherosclerotische plaque is een 3D-fenomeen en metingen uitgevoerd in een 2D-vlak weerspiegelen mogelijk niet de ware omvang van de plaque. Naast de analyse van het plaquegebied van en face aorta, wordt aanbevolen om de plaquegrootte in de aortawortel, brachiocephalische slagader, oplopende aorta en abdominale aorta afzonderlijk te analyseren8. - Omcirkel de buitenste randlijn van de aorta en klik op "Meten" in het menu "Analyseren" om het aortagebied in het resultaatvenster weer te geven (figuur 6B rechts).
- Exporteer alle metingen naar een Excel-bestand.
- Bereken de verhouding van het plaqueoppervlak van het totale aortagebied en normaliseer de waarde als het percentage van het totale olierode O-oppervlak.
- Bereken de verhouding van het plaquegebied in 8-10 Apoe-/- en 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe muizen. Presenteer de gegevens als gemiddelde ± SEM (figuur 6C).
- Voer een ongepaarde Student's t-test uit voor statistische analyse van de verhouding van plaquegebiedgegevens in vergelijking met een andere muisgroep. Beschouw de verschillen in gemiddelde waarden als significant bij p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol werden atherosclerotische laesies in TGFβR2iSMC-Apoe-muizen geanalyseerd na 4 maanden op een HCHF-dieet7. Naast uitgebreide atherosclerose ontwikkelden deze muizen zowel thoracale als abdominale aorta-aneurysma's, zoals eerder gemeld. Vergeleken met Apoe-/- muizen vertoonden de aortawanden van TGFβR2iSMC-Apoe-muizen ernstige atherosclerose, waardoor het moeilijk was om de laesies te ontleden (figuur 2C, D, E). Bovendien zijn de aneurysma's bijzonder uitgebreid onder de suprarenale aorta, wat sterk doet denken aan geavanceerde menselijke aorta-aneurysma's.
Een representatieve ongeopende aorta Oil Red O-kleuringsafbeelding van de HCHFD-gevoede TGFβR2iSMC-Apoe-muis is weergegeven in figuur 3E. De afbeelding toont een TGFβR2iSMC-Apoe-muis die zowel oplopend als abdominaal aorta-aneurysma ontwikkelde, en het toont versnelde vorming van atherosclerotische laesies in aortatakken (hier de brachiocephalische slagader, halsslagader, subclavia slagaders, iliacale slagaders, femorale slagaders en nierslagaders).
Figuur 6A toont het en face Oil Red O kleuringsbeeld van Apoe-/- en TGFβR2iSMC-Apoe muizen. Vergeleken met de Apoe-/- groep vertoonden TGFβR2iSMC-Apoe-muizen ernstige aneurysmale vergroting en duidelijke verlenging van de gehele aorta.
Figuur 1: Dissectietools die in het protocol worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stap-voor-stap protocol voor excisie van aorta van muis op HCHF dieet.
Dit is van een 24 weken oude TGFβR2iSMC-Apoe muis gevoed gedurende 4 maanden op een hoog cholesterol hoog vet (HCHF) dieet. (A) Muis onder ketamine / xyleen anesthesie. Stippellijnen geven aan waar de huid moet worden gesneden. (B) Dissectie van de muis om de thoracale en buikholten bloot te leggen. (C) Zorgvuldige verwijdering van de inwendige organen (d.w.z. longen, lever, milt en gastro-intestinale en voortplantingsorganen), gevolgd door blootstelling van de muizenaorta onder een dissectiemicroscoop. (D) Zorgvuldig verwijderen van het bindweefsel langs de aorta zo schoon mogelijk. (E) Afbeelding van de geïsoleerde hele aorta met takken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stap-voor-stap protocol voor ongeopende aorta Oil Red O kleuring en beeldvorming.
(A) Pinnen van de hele aorta met takken op een was petrischaaltje. (B) Afdekking van de aorta met olierode O-kleuroplossing. (C) Illustratie van de gehele aorta na Oil Red O-kleuring. (D) Illustratie van olierode O-gekleurde hele aorta na reiniging. (E) Representatieve fotomicrografen van olierode O-gekleurde hele aorta van TGFβR2iSMC-Apoe-muizen na 4 maanden op een HCHF-dieet. a') Hoge vergrotingsbeeld van opstijgende aorta van (a), en (b') hoge vergrotingsbeeld van abdominale aorta van (b). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Stap-voor-stap protocol voor en face aorta voorbereiding.
(A,B) De arteriële boom gekleurd met Oil Red O wordt in de lengterichting geopend om de aorta af te vlakken voor beeldvorming. Stippellijnen langs de vaatwand en nummers geven opeenvolgende sneden aan die worden gemaakt om de vaten te openen. (C) In de lengterichting gespleten en hele aorta vastgepind op een wassen petrischaal in een Y-vorm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Stap-voor-stap protocol voor en face aorta montage.
(A) Zachte reiniging van de glazen microscoopglaasjes met 70% ethanol en drogen met schone laboratoriumdoekjes. (B) Toepassing van OCT-verbinding op het oppervlak van een glazen microscoopglaasje en vervolgens verspreiding van de en face aorta plat op de andere glazen microscoopglaasje. (C) Voorzichtige plaatsing van de glazen microscoopglaasdoos met OCT-verbinding bovenop het en face aortamonster. (D) Etikettering van de dia met de naam van het monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Step-by-step protocol voor en face aorta imaging en atherosclerotische laesie kwantificering.
(A) Microfoto's van en face aortas van Apoe-/- en TGFβR2iSMC-Apoe muizen na 4 maanden op een HCHF dieet en gekleurd met Oil Red O. (B) Afbeeldingen die het proces illustreren voor computerondersteunde kwantificering van atherosclerotische laesies. C) Kwantificering van het laesiegebied: % laesiegebied verwijst naar olierood O-gekleurd als een % van het totale aortaoppervlak. Alle gegevens die worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (***p < 0,001; ongepaarde tweezijdige Student's t-test; n = 9 voor Apoe-/- muizen en n = 9 voor TGFβR2iSMC-Apoe muizen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Myh11-Creert2 | 5'-TGA CCC CAT CTC TTC ACT CC-3' | |
| 5'-AAC TCC ACG ACC TCA TC-3' | ||
| 5'-AGT CCC TCA CAT CCT CAG GTT-3' | ||
| Tgfbr2fl/fl | 5'-TAA ACA AGG TCC GGA GCC CA-3' | |
| 5'-ACT TCT GCA AGA GGT CCC CT-3' | ||
| Apoe | 5'-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3' | |
| 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3' | ||
| 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3' | ||
Tabel 1: Genotyperingsprimers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apolipoproteïne E (Apoe) en low density lipoprotein receptor (Ldlr) deficiënte muizen zijn nuttig voor het bestuderen van de ontwikkeling en behandeling van atherosclerose. Onderzoekers kunnen de impact van genetica en therapeutische manipulaties op atherosclerose-gerelateerde ziekten initiatie, progressie en regressie evalueren met behulp van Oil Red O-kleuring van de hele aorta9. Aorta Oil Red O-kleuring en laesiekwantificering is het gouden standaardeindpunt voor atherosclerose-onderzoek. Deze techniek is goedkoop en vereist geen speciale apparatuur10. Het is echter niet eenvoudig om olierood O-gekleurd weefsel van hoge kwaliteit te verkrijgen. Op basis van eerdere ervaring zijn er drie kritieke stappen in dit protocol en de hele procedure vereist oefening en geduld. De eerste kritieke stap is het vermogen om al het perivasculaire vetweefsel rond de aorta en zijn takken te ontleden, verwijderen en reinigen voor en na Oil Red O-kleuring (Figuur 2D, Figuur 3C, D). De tweede belangrijke stap is de bereiding van vers gemaakte en gefilterde Oil Red O-oplossing. Ten slotte is het van belang dat de en face aorta plat op een wasschaal ligt voordat deze op de glazen microscoopglaasjes wordt gemonteerd (figuur 4C, figuur 5B,C).
In vergelijking met andere Oil Red O-kleuringsprotocollen biedt deze methode kwalitatieve en kwantitatieve beoordelingen van met lipiden beladen plaques in de ongeopende aorta en en face aorta van een enkele muis. De eerste kwalitatieve beoordeling van de ongeopende Oil Red O-kleuring geeft een algemeen idee over de plaqueverdeling en plaquegrootte in aorta, evenals alle takken vóór kwantificering van de en face aorta. Beperkingen van de studie zijn dat (1) 2D-vergelijking en analyse van 3D-atherosclerotische plaques niet de ware omvang van atherosclerotische plaquevolumes weerspiegelt, (2) kwantificering van atherosclerotische laesies tijdrovend is en (3) het dierenoffers vereist.
Nadat de aorta met succes is geïsoleerd, kan deze worden gebruikt voor een breed scala aan testen voor moleculaire studies. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor biomechanische studies en histologische analyse om de kathodale aortamorfologie te karakteriseren11. Bovendien kunnen gebruikers endotheelcellen en gladde spiercellen isoleren uit vers geïsoleerde hele aorta voor celkweek, FACS-analyse en eencellige RNA-sequencinganalyse. Samenvattend biedt dit protocol een stapsgewijze procedure om atherosclerotische belasting bij muizen te analyseren. Onderzoekers kunnen dit protocol gebruiken om de overvloed, locatie en grootte van atherosclerotische laesies tussen dieren te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Joint Biology Consortium Microgrant verstrekt onder NIH-subsidie P30AR070253 (P.-Y.C.), en HL135582 (MS). We zijn R. Webber en L. Coon dankbaar voor het onderhoud van de muizen die in deze studie zijn gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J.
- Emini Veseli, B., et al.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
