تحليل شبكة α أكتينين في الخلايا القلبية المشتقة من iPSC باستخدام المجهر توطين جزيء واحد
Summary
تشكيل شبكة ساركومير المناسبة مهم لنضوج القلب المشتق من iPSC. نقدم نهجًا فائقًا قائمًا على القرار يسمح بالتقييم الكمي للنضج الهيكلي للخلايا الجذعية المشتقة من خلايا القلب، لتحسين ظروف الثقافة التي تعزز تطور القلب.
Abstract
نضوج القلب المشتق من iPSC هو قضية حاسمة لتطبيقها في العلاج التجديدي واختبار الأدوية وطراز الأمراض. على الرغم من تطوير بروتوكولات التمايز المتعددة ، فإن توليد عضلة القلب iPSC تشبه النمط الظاهري الشبيه بالراشد لا يزال صعبًا. أحد الجوانب الرئيسية لنضوج القلب و القلب ينطوي على تشكيل شبكة ساركومير منظمة تنظيما جيدا لضمان قدرة انكماش عالية. هنا، نقدم نهج فائقة القرار القائم على التحليل شبه الكمي لشبكة α actinin في cardiomyocytes. باستخدام المجهر التعريب photoactivated مقارنة طول السارومير وسمك القرص z من خلايا القلب المشتقة من iPSC والخلايا القلبية المعزولة عن أنسجة حديثي الولادة تم تنفيذها. في الوقت نفسه، نبرهن على أهمية ظروف التصوير المناسبة للحصول على بيانات موثوقة. تظهر نتائجنا أن هذه الطريقة مناسبة لمراقبة كمية النضج الهيكلي للخلايا القلبية ذات الدقة المكانية العالية ، مما يتيح الكشف عن التغيرات الدقيقة في تنظيم الساركومير.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) مثل احتشاء عضلة القلب أو اعتلال عضلة القلب لا تزال السبب الرئيسي للوفاة في العالم الغربي1. وبما أن قلب الإنسان لا يملك سوى ضعف القدرة التجديدية، هناك حاجة إلى استراتيجيات لتعزيز التعافي من الأمراض القلبية الوعائية. وهذا يشمل العلاجات استبدال الخلايا لتجديد خلايا القلب المفقودة (CM)، فضلا عن تطوير أدوية جديدة لمكافحة عدم انتظام النشاط التدخل الدوائي آمنة وفعالة. وقد تبين أن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) مصدر خلية واعدة للجيل غير محدود من CM الإنسان في المختبر، ومناسبة للعلاجات التجديدية، ونمذجة المرض، وتطوير فحص المخدرات المقايسات2،3،4.
على الرغم من وجود العديد من بروتوكولات تمايز القلب المختلفة ، لا يزال يوجد CM مشتق من iPSC بعض الجوانب الظاهرية والوظيفية التي تعوق المختبر وفي تطبيق vivo5،6. بجانب التغيرات الكهربية ، الأيضية ، والجزيئية ، تتضمن عملية نضوج القلب التنظيم الهيكلي للساركوميريات ، وهي الوحدات الأساسية المطلوبة لتوليد القوة وانكماش الخلايا7. في حين أن كبار CMs المعرض جهاز التعاقد منظمة تنظيما جيدا، وCMs المشتقة من iPSC عادة ما تظهر خيوط ساركومير غير مرتبة، المرتبطة انخفاض القدرة على الانكماش وتغيير ديناميات الانكماش8،9. على النقيض من درجة الحرارة الناضجة التي تظهر نمط انكماش uniaxial ، والهياكل مشوشة في نتائج CM غير ناضجة في تقلص شعاعي للخلية بأكملها أو تعزيز ظهور نقاط التركيز انكماش9،10.
لتحسين نضوج القلب، وقد تم تطبيق نهج متعددة، بما في ذلك 3D وسائل زراعة الخلايا، والتحفيز الكهربائي والميكانيكية، فضلا عن استخدام مصفوفات خارج الخلية محاكاة في ظروف الجسم الحي11،12،13. لتقييم نجاح وكفاءة هذه الظروف الثقافية المختلفة ، هناك حاجة إلى تقنيات لرصد وتقدير درجة النضج الهيكلي لـ iPSC CM ، على سبيل المثال ، عن طريق التقنيات المجهرية. على النقيض من التصوير confocal التقليدية، دقة في حالة المجهر تعريب مبطل ضوئي (بالم) هو ما يقرب من 10x أعلى. هذه التقنية بدورها تسمح لتحليل أكثر دقة، والكشف عن التعديلات حتى خفية من الهياكل الخلوية14. وبالنظر إلى الدقة العالية للتصوير القائم على النخلة، كان الهدف العام من هذه الطريقة هو التقييم المجهري لنضج الساروميري في CMS المشتقة من iPSC عن طريق التحديد الدقيق لسمك القرص z وطول الساركومير. في الدراسات السابقة، وقد تبين أن هذه السمات الهيكلية لتكون المعلمات المناسبة لتقييم نضج القلب15. على سبيل المثال، المرضى iPSC-CM تفتقر كامل طول ديستروفين معرض انخفاض طول الساركومير وعرض z-الفرقة بالمقارنة مع خلايا نوع البرية16. وبالمثل، تم قياس طول الساركوميريات الفردية للتحقيق في تأثير الإشارات الطبوغرافية على تطوير القلب16. ومن ثم، قمنا بتطبيق هذا النهج لتقييم النضج الهيكلي لشبكة ساركومير في iPSC-CM عن طريق قياس كمية طول الساركومير وسمك القرص z.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن توليد CM المشتق من iPSC الوظيفي في المختبر مهم للعلاجات التجديدية ، والنمذجة المرض وتطوير منصات فحص المخدرات. ومع ذلك، النضج غير الكافي لهذه CM عقبة رئيسية في أبحاث القلب والأوعية الدموية20. وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى تقنيات تصوير عالية الدقة تمكن من رصد حالة النضج الهيكلي لـ …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذه الدراسة الصندوق الهيكلي للاتحاد الأوروبي (ESF/14-BM-A55-0024/18). بالإضافة إلى ذلك، يتم دعم H.L. من قبل برنامج FORUN من المركز الطبي لجامعة روستوك (889001 و 889003) ومؤسسة جوزيف وكاثي كلينز (T319/29737/2017). ويدعم C.I.L. من قبل برنامج العلماء السريرية للمركز الطبي جامعة روستوك. ويدعم R.D من قبل DFG (DA1296/6-1)، ومؤسسة دامب، ومؤسسة القلب الألمانية (F/01/12) وBMBF (VIP+ 00240).
نشكر مادلين بارتش على دعمها الفني في ثقافة خلايا iPSC وتمايز القلب.
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. , (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
