Análisis de la red α-Actinin en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC mediante microscopía de localización de molécula única
Summary
La formación de una red adecuada de sarcomere es importante para la maduración de los cardiomiocitos derivados del iPSC. Presentamos un enfoque basado en la super resolución que permite la evaluación cuantitativa de la maduración estructural de los cardiomiocitos derivados de células madre, para mejorar las condiciones de cultivo promoviendo el desarrollo cardíaco.
Abstract
La maduración de los cardiomiocitos derivados de iPSC es un problema crítico para su aplicación en la terapia regenerativa, las pruebas de drogas y el modelado de enfermedades. A pesar del desarrollo de múltiples protocolos de diferenciación, la generación de cardiomiocitos iPSC que se asemejan a un fenotipo similar a un adulto sigue siendo un reto. Un aspecto importante de la maduración de los cardiomiocitos consiste en la formación de una red de sarcomere bien organizada para garantizar una alta capacidad de contracción. Aquí, presentamos un enfoque basado en la superrescencia para el análisis semicuantitativo de la red α-actinina en cardiomiocitos. Mediante la microscopía de localización fotoactivada se realizó una comparación de la longitud de los sarcomos y el grosor del disco z de los cardiomiocitos derivados de iPSC y las células cardíacas aisladas del tejido neonatal. Al mismo tiempo, demostramos la importancia de las condiciones de imagen adecuadas para obtener datos fiables. Nuestros resultados muestran que este método es adecuado para monitorear cuantitativamente la madurez estructural de las células cardíacas con alta resolución espacial, permitiendo la detección de cambios incluso sutiles de la organización del sarcomere.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares (ECV) como el infarto de miocardio o la miocardiopatía siguen siendo la principal causa de muerte en el mundo occidental1. Como el corazón humano sólo posee una mala capacidad regenerativa, es necesario establecer estrategias para promover la recuperación de las enfermedades cardiovasculares. Esto incluye terapias de reemplazo celular para reponer los cardiomiocitos perdidos (CM), así como el desarrollo de nuevos fármacos antiarrítmicos para una intervención farmacéutica eficiente y segura. Se ha demostrado que las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son una fuente celular prometedora para la generación ilimitada de CM humano in vitro, adecuada para terapias regenerativas, modelado de enfermedades y para el desarrollo de ensayos de detección de fármacos2,,3,,4.
Aunque existen muchos protocolos de diferenciación cardiaca diferentes, la CM derivada de iPSC todavía carece de ciertos aspectos fenotípicos y funcionales que impiden la aplicación in vitro e in vivo5,6. Además de los cambios electrofisiológicos, metabólicos y moleculares, el proceso de maduración cardíaca implica la organización estructural de los sarcomeres, que son las unidades fundamentales necesarias para la generación de fuerza y la contracción celular7. Mientras que los CM adultos exhiben un aparato contráctil bien organizado, los CM derivados de iPSC suelen demostrar filamentos de sarcomer desarbanados, asociados con una capacidad de contracción reducida y una dinámica de contracción alterada8,,9. A diferencia de la CM madura que muestra un patrón de contracción noxial, las estructuras desorientadas en CM inmaduro resulta en una contracción radial de toda la célula o promueven la aparición de puntos focales de contracción9,,10.
Para mejorar la maduración cardiaca, se han aplicado múltiples enfoques, incluyendo métodos de cultivo celular 3D, estimulación eléctrica y mecánica, así como el uso de matrices extracelulares que imitan las condiciones in vivo11,,12,,13. Para evaluar el éxito y la eficiencia de estas diferentes condiciones de cultivo, se necesitan técnicas para monitorear y estimar el grado de maduración estructural del iPSC CM, por ejemplo, mediante técnicas microscópicas. A diferencia de las imágenes confocales convencionales, la resolución en caso de microscopía de localización fotoactivada (PALM) es aproximadamente 10 veces mayor. Esta técnica a su vez permite un análisis más preciso, detectando incluso alteraciones sutiles de las estructuras celulares14. Teniendo en cuenta la alta resolución de las imágenes basadas en PALM, el objetivo general de este método fue la evaluación microscópica de la madurez de los sarcomeres en los CM derivados de iPSC mediante la determinación precisa del espesor del z-Disc y la longitud del sarcomere. En estudios anteriores, se ha demostrado que estas características estructurales son parámetros adecuados para evaluar la madurez cardíaca15. Por ejemplo, el iPSC-CM enfermo que carece de distrofina de longitud completa exhibe una longitud reducida de sarcomere y ancho de banda z en comparación con las celdas de tipo salvaje16. Del mismo modo, se midió la longitud de los sarcomeres individuales para investigar el impacto de las señales topográficas en el desarrollo cardíaco16. Por lo tanto, aplicamos este enfoque para evaluar la maduración estructural de la red de sarcomere en iPSC-CM midiendo cuantitativamente la longitud de sarcomere y el espesor del disco z.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generación de CM in vitro funcional derivada de iPSC es importante para las terapias regenerativas, el modelado de enfermedades y el desarrollo de plataformas de detección de fármacos. Sin embargo, la madurez insuficiente de estos CM es un obstáculo importante en la investigación cardiovascular20. En este sentido, se necesitan técnicas de imagen de alta resolución que permitan supervisar el estado de maduración estructural de la CM derivada de iPSC. Al mismo tiempo, la microscopía de s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio contó con el apoyo del Fondo Estructural de la UE (FSE/14-BM-A55-0024/18). Además, H.L. cuenta con el apoyo del Programa FORUN del Centro Médico de la Universidad de Rostock (889001 y 889003) y la Fundación Josef y Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. es apoyado por el Programa Científico Clínico del Centro Médico de la Universidad de Rostock. R.D cuenta con el apoyo de la DFG (DA1296/6-1), la fundación DAMP, la Fundación Alemana del Corazón (F/01/12) y la BMBF (VIP+ 00240).
Agradecemos a Madeleine Bartsch por su apoyo técnico en el cultivo celular iPSC y la diferenciación cardíaca.
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
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