단일 분자 국소화 현미경 검사를 사용하여 인간 iPSC 파생 심근세포에서 α-액티닌 네트워크 분석

Summary

적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.

Abstract

iPSC 유래 심근세포의 성숙은 재생 치료, 약물 검사 및 질병 모델링에 있는 그들의 신청에 대한 중요한 문제점입니다. 다중 분화 프로토콜의 발달에도 불구하고 성인과 같은 표현형을 닮은 iPSC 심근세포의 생성은 여전히 도전적입니다. 심근 세포 성숙의 한 가지 주요 측면은 높은 수축 용량을 보장하기 위해 잘 조직 된 sarcomere 네트워크의 형성을 포함한다. 여기에서는 심근세포에서 α 액티닌 네트워크의 반정량 분석을 위한 슈퍼 분해능 기반 접근 방식을 제시합니다. 광활성화 국소화 현미경을 사용하여 신생아 조직으로부터 분리된 iPSC 유래 심근세포 및 심장 세포의 사코프레 길이 및 z-디스크 두께의 비교가 수행되었다. 동시에 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 적절한 이미징 조건의 중요성을 입증합니다. 우리의 결과는 이 방법이 높은 공간 해상도로 심장 세포의 구조적 성숙도를 정량적으로 모니터링하는 데 적합하다는 것을 보여 주어 sarcomere 조직의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다.

Introduction

심근 경색 또는 심근병증과 같은 심혈관 질환(CVD)은 서구 세계^1에서주요 사망 원인으로 남아 있다. 인간의 심장은 가난한 재생 능력을 가지고 있기 때문에, CVD에서 회복을 촉진하기위한 전략에 대한 필요가있다. 여기에는 분실된 심근세포(CM)를 보충하기 위한 세포 대체 요법뿐만 아니라 효율적이고 안전한 제약 개입을 위한 새로운 부정맥 약물의 개발이 포함됩니다. 유도만능 줄기세포(iPSC)는 생체외에서 인간 CM의 무제한 생성을 위한 유망한 세포공급원으로 나타났으며, 재생 요법, 질병 모델링, 약물 스크리닝 어세서^2,,3,,4의개발에 적합하게 된다.

많은 다른 심장 분화 프로토콜이 존재하지만, iPSC 유래 CM은 여전히 시험관 내 및 생체 내 응용 프로그램^5,,6을방해하는 특정 표현성 및 기능적 측면이 부족하다. 전기 생리학, 대사 및 분자 변화 외에도 심장 성숙 과정은 힘 생성 및 세포^수축7에필요한 기본 단위인 sarcomeres의 구조 적 조직을 포함한다. 성인 CM은 잘 조직된 수축 장치를 전시하는 동안, iPSC 유래 CM은 일반적으로 수축 능력 감소 및 변경된 수축 역학과 관련된 분리된 사코레 필라멘트를 입증한다^8,,9. 단축 수축 패턴을 보이는 성숙한 CM과는 달리, 미숙한 CM의 방향감각 구조는 전체 세포의 방사형 수축을 초래하거나 수축 초점점^9,,10의출현을 촉진한다.

심장 성숙을 개선하기 위해 3D 세포 배양 방법, 전기 및 기계적 자극뿐만 아니라 생체 조건에서 모방된 세포외 행렬의^{사용(11,,12,13)을}포함한 여러^접근법이적용되었다. 이러한 다양한 배양 조건의 성공과 효율성을 평가하기 위해서는 미세한 기술로 iPSC CM의 구조적 성숙 정도를 모니터링하고 추정하기 위한 기술이 필요합니다. 기존의 공초점 영상과는 달리, 광활성화 국소화 현미경검사(PALM)의 경우 해상도는 약 10배 더 높다. 이 기술은 차례로 세포 구조물의 미묘한 변경을 검출하는 더 정확한 분석을 가능하게^{합니다(14)}. PALM 기반 이미징의 고해상도를 고려할 때, 이 방법의 전반적인 목표는 z-Disc 두께 및 사코메 길이의 정확한 측정에 의한 iPSC 유래 CM에서 sarcomere 성숙도의 현미경 평가였습니다. 이전 연구에서, 이러한 구조적 특징은 심장 성숙도를 평가하기 에 적합한 매개 변수로 표시되었습니다^(15. 예를 들어, 병에 걸린 iPSC-CM전체 길이 디스트로핀이 부족한 경우 야생형^{세포(16)와}비교했을 때 사코름 길이및 z대역 폭이 감소한다. 마찬가지로, 개별 사파레의 길이는 심장 발달에 지형 단서의 충격을 조사하기 위하여 측정되었다^16. 따라서, 우리는 정량적으로 sarcomere 길이와 z 디스크 두께를 측정하여 iPSC-CM에서 sarcomere 네트워크의 구조적 성숙을 평가하기 위해이 접근 방식을 적용했다.

Protocol

신생아와 성인 마우스를 관련시키는 이 프로토콜에 있는 모든 단계는 로스톡 대학 의료 센터의 동물 배려를 위한 윤리적인 지침에 따라 수행되었습니다. 1. iPSC 유래 심근세포의 재배 및 해리 이전에설명된 바와 같이 2D 단층 방법을 사용하여 25일 동안 hiPSC-CM을 차별화한다. 37°C에 미리 떼어내며 중온에서 실온을 지원합니다. PBS로 셀을 …

Representative Results

CM의 구조적 성숙 정도를 추정하기 위해 신생아, 완전 성숙한 성인 및 iPSC CM은 처음에 α 액틴 항체로 CM을 표시하여 사코메르 네트워크를 시각화했다. PALM 수집 후 이미지를 재구성하고 개별 필라멘트의 폭을 자동으로 감지하기 위해 플러그인 기반 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 z 디스크 두께를 측정했습니다. Sarcomere 길이는 인접한 필라멘트에 해당하는 두 개의 인접한 강도 피크 사이의 거?…

Discussion

시험관 내 기능성 iPSC 유래 CM의 생성은 재생 치료, 질병 모델링 및 약물 선별 플랫폼의 개발에 중요합니다. 그러나, 이러한 CM의 불충분 한 성숙은 심장 혈관 연구에서 주요^{장애물이다 20.} 이와 관련하여 iPSC 유래 CM의 구조적 성숙 상태를 모니터링할 수 있는 고해상도 이미징 기술이 필요합니다. 동시에, 슈퍼 분해능 현미경 검사는 최근 티틴 및^,트로포닌(10,^10<…

Materials

human iPSC cell line	Takara	Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom	ibidi	80827
0.5ml eppendorf tube	Eppendorf	30121023
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit	Stem Cell Technologies	05025
Catalase	Sigma Aldrich	C40-1G
Cyclooctatetraene	Sigma Aldrich	138924-1G
Cysteamine	Sigma Aldrich	30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher	14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose	Carl Roth	X997.2
Hydrochloric acid	Sigma Aldrich	H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Paraformaldehyde	Merck	8187150100
Pyranose oxidase	Sigma Aldrich	P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53]	Abcam	ab9465
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653
sterile water	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689