Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie
Summary
Die Bildung eines richtigen Sarcomere-Netzwerks ist wichtig für die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten. Wir präsentieren einen super Auflösungs-basierten Ansatz, der die quantitative Bewertung der strukturellen Reifung von Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten ermöglicht, um die Kulturbedingungen zu verbessern, die die Herzentwicklung fördern.
Abstract
Die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist ein kritisches Thema für ihre Anwendung in der regenerativen Therapie, Medikamententests und Krankheitsmodellierung. Trotz der Entwicklung mehrerer Differenzierungsprotokolle bleibt die Erzeugung von iPSC-Kardiomyozyten, die einem erwachsenen Phänotyp ähneln, eine Herausforderung. Ein wichtiger Aspekt der Kardiomyozytenreifung ist die Bildung eines gut organisierten Sarcomere-Netzwerks, um eine hohe Kontraktionskapazität zu gewährleisten. Hier stellen wir einen super auflösungsbasierten Ansatz für die semiquantitative Analyse des α-Actinin-Netzwerks in Kardiomyozyten vor. Mit hilfe der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie wurde ein Vergleich der Sarkomelänge und der Z-Scheibendicke von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und herzisolierten Herzzellen aus neonatalem Gewebe durchgeführt. Gleichzeitig zeigen wir, wie wichtig geeignete Bildgebungsbedingungen sind, um zuverlässige Daten zu erhalten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Methode geeignet ist, die strukturelle Reife von Herzzellen mit hoher räumlicher Auflösung quantitativ zu überwachen, was den Nachweis selbst subtiler Veränderungen der Sarcomere-Organisation ermöglicht.
Introduction
Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) wie Myokardinfarkt oder Kardiomyopathie bleiben die Haupttodesursache in der westlichen Welt1. Da das menschliche Herz nur über schlechte Regenerationsfähigkeit verfügt, bedarf es Strategien, um die Erholung von CVDs zu fördern. Dazu gehören Zellersatztherapien zur Auffüllung verlorener Kardiomyozyten (CM) sowie die Entwicklung neuer antiarrhythmischer Medikamente für eine effiziente und sichere pharmazeutische Intervention. Induzierte pluripotente Stammzelle (iPSC) haben sich als vielversprechende Zellquelle für die unbegrenzte Generierung von humanem CM in vitro erwiesen, geeignet für regenerative Therapien, Krankheitsmodellierung, und für die Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Assays2,3,4.
Obwohl es viele verschiedene kardiale Differenzierungsprotokolle gibt, fehlt es iPSC-abgeleitetem CM noch immer an bestimmten phänotypischen und funktionellen Aspekten, die die In-vitro- und In-vivo-Anwendung behindern5,6. Neben elektrophysiologischen, metabolischen und molekularen Veränderungen beinhaltet der Herzreifungsprozess die strukturelle Organisation von Sarkomen, die die grundlegenden Einheiten sind, die für die Kraftgenerierung und Zellkontraktion erforderlich sind7. Während erwachsene CMs ein gut organisiertes kontraktiles Gerät aufweisen, zeigen iPSC-abgeleitete CMs häufig disarrangierte Sarcomere-Filamente, die mit einer reduzierten Kontraktionsfähigkeit und veränderten Kontraktionsdynamik8,9verbunden sind. Im Gegensatz zu reifen CM, die uniaxiale Kontraktionsmuster zeigen, führen die desorientierten Strukturen in unreifen CM zu einer radialen Kontraktion der ganzen Zelle oder fördern das Auftreten von Kontraktionsschwerpunkten9,10.
Zur Verbesserung der Herzreife wurden mehrere Ansätze angewendet, einschließlich 3D-Zellkulturmethoden, elektrische und mechanische Stimulation sowie die Verwendung extrazellulärer Matrizen, die in vivo Bedingungen11,12,13imitieren. Um den Erfolg und die Effizienz dieser verschiedenen Kulturbedingungen zu bewerten, sind Techniken erforderlich, um den Grad der strukturellen Reifung von iPSC CM zu überwachen und abzuschätzen, z. B. durch mikroskopische Techniken. Im Gegensatz zur herkömmlichen konfokalen Bildgebung ist die Auflösung bei der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) etwa 10-fach höher. Diese Technik wiederum ermöglicht eine genauere Analyse, die auch subtile Veränderungen der zellulären Strukturen erkennt14. Unter Berücksichtigung der hohen Auflösung der PALM-basierten Bildgebung war das übergeordnete Ziel dieser Methode die mikroskopische Bewertung der Sarkomereife in iPSC-abgeleiteten CMs durch präzise Bestimmung der Z-Scheibendicke und Sarcomere-Länge. In früheren Studien haben sich diese strukturellen Merkmale als geeignete Parameter zur Beurteilung der Herzreife erwiesen15. Zum Beispiel, kranke iPSC-CM fehlt volle Länge Dystrophin zeigen reduzierte Sarcomere Länge und Z-Bandbreite Breite im Vergleich zu Wild-Typ-Zellen16. Ebenso wurde die Länge der einzelnen Sarkome gemessen, um die Auswirkungen topografischer Hinweise auf die Herzentwicklung zu untersuchen16. Daher haben wir diesen Ansatz angewandt, um die strukturelle Reifung des Sarcomere-Netzwerks in iPSC-CM zu bewerten, indem wir die Sarcomere-Länge und die Z-Scheibendicke quantitativ messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Generierung funktioneller iPSC-abgeleiteter CM in vitro ist wichtig für regenerative Therapien, Die Krankheitsmodellierung und die Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Plattformen. Jedoch, unzureichende Reife dieser CM ist ein großes Hindernis in der kardiovaskulären Forschung20. In diesem Zusammenhang sind hochauflösende Bildgebungstechniken erforderlich, die die Überwachung des strukturellen Reifungszustands von iPSC-abgeleitetem CM ermöglichen. Gleichzeitig kann die Superauflösungs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom EU-Strukturfonds (ESF/14-BM-A55-0024/18) unterstützt. Darüber hinaus wird H.L. durch das FORUN-Programm des Universitätsklinikums Rostock (889001 und 889003) und die Josef und Käthe Klinz Stiftung (T319/29737/2017) unterstützt. C.I.L. wird vom Clinician Scientist Program des Universitätsklinikums Rostock unterstützt. Gefördert wird die R.D. von der DFG (DA1296/6-1), der DAMP-Stiftung, der Deutschen Herzstiftung (F/01/12) und dem BMBF (VIP+ 00240).
Wir danken Madeleine Bartsch für ihre technische Unterstützung bei der iPSC-Zellkultur und der Herzdifferenzierung.
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
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