ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת
Summary
היווצרות של רשת sarcomere נכונה חשובה להתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC. אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר המאפשרת הערכה כמותית של התבגרות מבנית של תאי גזע נגזר cardiomyocytes, כדי לשפר את תנאי התרבות קידום התפתחות הלב.
Abstract
ההתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC היא בעיה קריטית עבור היישום שלהם בטיפול רגנרטיבי, בדיקות סמים ומידול מחלות. למרות הפיתוח של פרוטוקולי בידול מרובים, הדור של קרדיומיוציטים iPSC הדומה לפנוטיפ כמו מבוגר נשאר מאתגר. אחד ההיבטים העיקריים של התבגרות cardiomyocytes כרוך היווצרות של רשת sarcomere מאורגן היטב כדי להבטיח קיבולת התכווצות גבוהה. כאן, אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר לניתוח חצי כמותי של רשת α-actin ב cardiomyocytes. באמצעות מיקרוסקופית מקומיות פוטואקטיבית השוואה של אורך sarcomere ועובי z-disc של קרדיומיוציטים נגזר iPSC ותאי לב מבודדים רקמת יילודים בוצע. במקביל, אנו מדגימים את החשיבות של תנאי הדמיה נאותים להשגת נתונים אמינים. התוצאות שלנו מראות כי שיטה זו מתאימה לניטור כמותי של הבשלות המבנית של תאי לב ברזולוציה מרחבית גבוהה, המאפשרת זיהוי של שינויים עדינים אף יותר של ארגון sarcomere.
Introduction
מחלות לב וכלי דם (CVD) כגון אוטם שריר הלב או קרדיומיופתיה להישאר הגורם העיקרי למוות בעולם המערבי1. מכיוון שללב האנושי יש יכולת התחדשות ירודה בלבד, יש צורך באסטרטגיות לקידום ההתאוששות מ-CVDs. זה כולל טיפולים להחלפת תאים כדי לחדש את קרדיומיוציטים אבודים (CM), כמו גם את הפיתוח של תרופות אנטי-קצביות חדשות להתערבות יעילה ובטוחה בסמים. המושרה תאי גזע pluripotent (iPSC) הוצגו כמקור תא מבטיח לדור בלתי מוגבל של CM אנושי במבחנה, מתאים טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות, ופיתוח של תרופות הקרנה assays2,,3,,4.
למרות פרוטוקולים רבים ושונים של בידול לב קיימים, CM נגזר iPSC עדיין חסר היבטים פנוטיפיים ופונקציונליים מסוימים המנועים במבחנה וביישום vivo5,6. לצד שינויים אלקטרופיזיולוגיים, מטבוליים ומולקולריים, תהליך ההתבגרות הלברית כרוך בארגון המבני של סרקומרים, שהם היחידות הבסיסיות הנדרשות להדרת כוח והתכווצותתאים 7. בעוד CMs למבוגרים להפגין מערכת התכווצות מאורגן היטב, CMs נגזר iPSC בדרך כלל להפגין נרים סרקום פירוק, הקשורים יכולת התכווצות מופחתת דינמיקת התכווצותשונה 8,9. בניגוד ל-CM בוגר ההראה תבנית התכווצות חד-אקסיאלית, המבנים המבולבלים ב-CM לא בוגר גורמת להתכווצות רדיאלית של התא כולו או מקדמים את הופעתם שלנקודות מוקד התכווצות 9,10.
לשיפור התבגרות הלב, גישות מרובות הוחלו, כולל שיטות תרבות תא 3D, גירוי חשמלי ומכני, כמו גם את השימוש מטריצות חוץ תאיות מחקה בתנאי vivo11,12,13. כדי להעריך את ההצלחה והיעילות של תנאי תרבות שונים אלה, יש צורך בטכניקות כדי לפקח ולהעריך את מידת ההתבגרות המבנית של iPSC CM, למשל, על ידי טכניקות מיקרוסקופיות. בניגוד להדמיה קונבנציונלית, הרזולוציה במקרה של מיקרוסקופיה פוטואקטיבית לתיקליזציה (PALM) גבוהה בכ-10 פעמים. טכניקה זו בתורה מאפשרת ניתוח מדויק יותר, זיהוי שינויים עדינים אפילו של מבנים תאיים14. בהתחשב ברזולוציה גבוהה של הדמיה מבוססת PALM, המטרה הכוללת של שיטה זו הייתה הערכה מיקרוסקופית של בגרות sarcomere ב-iPSC נגזר CMs על ידי קביעה מדויקת של עובי z-Disc ואורך sarcomere. במחקרים קודמים, תכונות מבניות אלה הראו להיות פרמטרים מתאימים כדי להעריך את בגרות הלב15. לדוגמה, iPSC-CM מחלה חסר תצוגת דיסטרופין באורך מלא מופחת אורך sarcomere ורוחב z-band בהשוואה לתאי סוג בר16. כמו כן, אורך סרקומרים בודדים נמדד כדי לחקור את ההשפעה של רמזים טופוגרפיים על התפתחות הלב16. לפיכך, יישם גישה זו כדי להעריך את ההתבגרות המבנית של רשת sarcomere ב iPSC-CM על ידי מדידה כמותית של אורך sarcomere ועובי z-disc.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדור של CM פונקציונלי נגזר iPSC במבחנה חשוב עבור טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות ופיתוח של פלטפורמות סינון סמים. עם זאת, בגרות לא מספיקה של CM אלה הוא מכשול מרכזי במחקר לב וכלידם 20. בהקשר זה, דרושות טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרות ניטור של מצב ההתבגרות המבנית של CM הנגזר מ-iPSC….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן המבנית של האיחוד האירופי (ESF/14-BM-A55-0024/18). בנוסף, H.L. נתמכת על ידי תוכנית FORUN של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק (889001 ו 889003) וקרן יוזף וקתה קלינץ (T319/29737/2017). C.I.L. נתמך על ידי תוכנית המדען הקליני של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק. R.D נתמכת על ידי ה-DFG (DA1296/6-1), קרן DAMP, קרן הלב הגרמנית (F/01/12) וה-BMBF (VIP+ 00240).
אנו מודים מדלן Bartsch על התמיכה הטכנית שלה בתרבות תאי iPSC ובידול לב.
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. , (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
