היווצרות של רשת sarcomere נכונה חשובה להתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC. אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר המאפשרת הערכה כמותית של התבגרות מבנית של תאי גזע נגזר cardiomyocytes, כדי לשפר את תנאי התרבות קידום התפתחות הלב.
ההתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC היא בעיה קריטית עבור היישום שלהם בטיפול רגנרטיבי, בדיקות סמים ומידול מחלות. למרות הפיתוח של פרוטוקולי בידול מרובים, הדור של קרדיומיוציטים iPSC הדומה לפנוטיפ כמו מבוגר נשאר מאתגר. אחד ההיבטים העיקריים של התבגרות cardiomyocytes כרוך היווצרות של רשת sarcomere מאורגן היטב כדי להבטיח קיבולת התכווצות גבוהה. כאן, אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר לניתוח חצי כמותי של רשת α-actin ב cardiomyocytes. באמצעות מיקרוסקופית מקומיות פוטואקטיבית השוואה של אורך sarcomere ועובי z-disc של קרדיומיוציטים נגזר iPSC ותאי לב מבודדים רקמת יילודים בוצע. במקביל, אנו מדגימים את החשיבות של תנאי הדמיה נאותים להשגת נתונים אמינים. התוצאות שלנו מראות כי שיטה זו מתאימה לניטור כמותי של הבשלות המבנית של תאי לב ברזולוציה מרחבית גבוהה, המאפשרת זיהוי של שינויים עדינים אף יותר של ארגון sarcomere.
מחלות לב וכלי דם (CVD) כגון אוטם שריר הלב או קרדיומיופתיה להישאר הגורם העיקרי למוות בעולם המערבי1. מכיוון שללב האנושי יש יכולת התחדשות ירודה בלבד, יש צורך באסטרטגיות לקידום ההתאוששות מ-CVDs. זה כולל טיפולים להחלפת תאים כדי לחדש את קרדיומיוציטים אבודים (CM), כמו גם את הפיתוח של תרופות אנטי-קצביות חדשות להתערבות יעילה ובטוחה בסמים. המושרה תאי גזע pluripotent (iPSC) הוצגו כמקור תא מבטיח לדור בלתי מוגבל של CM אנושי במבחנה, מתאים טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות, ופיתוח של תרופות הקרנה assays2,,3,,4.
למרות פרוטוקולים רבים ושונים של בידול לב קיימים, CM נגזר iPSC עדיין חסר היבטים פנוטיפיים ופונקציונליים מסוימים המנועים במבחנה וביישום vivo5,6. לצד שינויים אלקטרופיזיולוגיים, מטבוליים ומולקולריים, תהליך ההתבגרות הלברית כרוך בארגון המבני של סרקומרים, שהם היחידות הבסיסיות הנדרשות להדרת כוח והתכווצותתאים 7. בעוד CMs למבוגרים להפגין מערכת התכווצות מאורגן היטב, CMs נגזר iPSC בדרך כלל להפגין נרים סרקום פירוק, הקשורים יכולת התכווצות מופחתת דינמיקת התכווצותשונה 8,9. בניגוד ל-CM בוגר ההראה תבנית התכווצות חד-אקסיאלית, המבנים המבולבלים ב-CM לא בוגר גורמת להתכווצות רדיאלית של התא כולו או מקדמים את הופעתם שלנקודות מוקד התכווצות 9,10.
לשיפור התבגרות הלב, גישות מרובות הוחלו, כולל שיטות תרבות תא 3D, גירוי חשמלי ומכני, כמו גם את השימוש מטריצות חוץ תאיות מחקה בתנאי vivo11,12,13. כדי להעריך את ההצלחה והיעילות של תנאי תרבות שונים אלה, יש צורך בטכניקות כדי לפקח ולהעריך את מידת ההתבגרות המבנית של iPSC CM, למשל, על ידי טכניקות מיקרוסקופיות. בניגוד להדמיה קונבנציונלית, הרזולוציה במקרה של מיקרוסקופיה פוטואקטיבית לתיקליזציה (PALM) גבוהה בכ-10 פעמים. טכניקה זו בתורה מאפשרת ניתוח מדויק יותר, זיהוי שינויים עדינים אפילו של מבנים תאיים14. בהתחשב ברזולוציה גבוהה של הדמיה מבוססת PALM, המטרה הכוללת של שיטה זו הייתה הערכה מיקרוסקופית של בגרות sarcomere ב-iPSC נגזר CMs על ידי קביעה מדויקת של עובי z-Disc ואורך sarcomere. במחקרים קודמים, תכונות מבניות אלה הראו להיות פרמטרים מתאימים כדי להעריך את בגרות הלב15. לדוגמה, iPSC-CM מחלה חסר תצוגת דיסטרופין באורך מלא מופחת אורך sarcomere ורוחב z-band בהשוואה לתאי סוג בר16. כמו כן, אורך סרקומרים בודדים נמדד כדי לחקור את ההשפעה של רמזים טופוגרפיים על התפתחות הלב16. לפיכך, יישם גישה זו כדי להעריך את ההתבגרות המבנית של רשת sarcomere ב iPSC-CM על ידי מדידה כמותית של אורך sarcomere ועובי z-disc.
הדור של CM פונקציונלי נגזר iPSC במבחנה חשוב עבור טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות ופיתוח של פלטפורמות סינון סמים. עם זאת, בגרות לא מספיקה של CM אלה הוא מכשול מרכזי במחקר לב וכלידם 20. בהקשר זה, דרושות טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרות ניטור של מצב ההתבגרות המבנית של CM הנגזר מ-iPSC….
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי הקרן המבנית של האיחוד האירופי (ESF/14-BM-A55-0024/18). בנוסף, H.L. נתמכת על ידי תוכנית FORUN של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק (889001 ו 889003) וקרן יוזף וקתה קלינץ (T319/29737/2017). C.I.L. נתמך על ידי תוכנית המדען הקליני של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק. R.D נתמכת על ידי ה-DFG (DA1296/6-1), קרן DAMP, קרן הלב הגרמנית (F/01/12) וה-BMBF (VIP+ 00240).
אנו מודים מדלן Bartsch על התמיכה הטכנית שלה בתרבות תאי iPSC ובידול לב.
human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
Fiji image processing software (Image J) | |||
Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |