Analisi della α-Actinin Network in Cardiomiociti derivati da iPSC umani utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola
Summary
La formazione di una corretta rete di sarcomi è importante per la maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC. Presentiamo un approccio basato sulla super risoluzione che consente la valutazione quantitativa della maturazione strutturale dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali, per migliorare le condizioni di coltura che promuovono lo sviluppo cardiaco.
Abstract
La maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC è un problema critico per la loro applicazione nella terapia rigenerativa, nel test farmacologico e nella modellazione della malattia. Nonostante lo sviluppo di più protocolli di differenziazione, la generazione di cardiomiociti iPSC simile a un fenotipo adulto rimane impegnativa. Un aspetto importante della maturazione dei cardiomiociti riguarda la formazione di una rete di sarcomi ben organizzata per garantire un’elevata capacità di contrazione. Qui, presentiamo un approccio basato sulla risoluzione super per l’analisi semi-quantitativa della α-actinin nei cardiomiociti. Utilizzando la microscopia di localizzazione fotoattivata è stato eseguito un confronto tra la lunghezza del sarcomere e lo spessore del disco z dei cardiomiociti derivati da iPSC e delle cellule cardiache isolate dal tessuto neonatale. Allo stesso tempo, dimostriamo l’importanza di condizioni di imaging adeguate per ottenere dati affidabili. I nostri risultati mostrano che questo metodo è adatto a monitorare quantitativamente la maturità strutturale delle cellule cardiache con alta risoluzione spaziale, consentendo il rilevamento di cambiamenti anche sottili dell’organizzazione dei sarcome.
Introduction
Le malattie cardiovascolari (CVD) come l’infarto miocardico o la cardiomiopatia rimangono la principale causa di morte nel mondo occidentale1. Poiché il cuore umano possiede solo una scarsa capacità rigenerativa, c’è bisogno di strategie per promuovere il recupero dalle CVD. Questo include terapie di sostituzione cellulare per ricostituire cardiomiociti persi (CM), così come lo sviluppo di nuovi farmaci anti-aritmici per un intervento farmaceutico efficiente e sicuro. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno dimostrato di essere una fonte di cellule promettente per la generazione illimitata di CM umano in vitro, adatta per terapie rigenerative, modellazione della malattia e per lo sviluppo di saggi di screening farmacologico2,3,4.
Sebbene esistano molti protocolli di differenziazione cardiaca diversi, il CM derivato da iPSC manca ancora di alcuni aspetti fenotipici e funzionali che ostacolano l’applicazione in vitro e in vivo5,6. Oltre ai cambiamenti elettrofisiologici, metabolici e molecolari, il processo di maturazione cardiaca coinvolge l’organizzazione strutturale dei sarcomere, che sono le unità fondamentali necessarie per la generazione di forza e la contrazionecellulare 7. Mentre le CCI adulte presentano un apparato contrattile ben organizzato, i CM derivati da iPSC dimostrano comunemente filamenti di sarcomero disarrangiati, associati a una ridotta capacità di contrazione e dinamiche di contrazionealterate 8,9. A differenza del CM maturo che mostra un modello di contrazione noniassiale, le strutture disorientate in CM immaturo si traduce in una contrazione radiale dell’intera cellula o promuovono la comparsa di punti focali di contrazione9,10.
Per migliorare la maturazione cardiaca, sono stati applicati diversi approcci, tra cui i metodi di coltura cellulare 3D, la stimolazione elettrica e meccanica, nonché l’uso di matrici extracellulari che imitano le condizioni di vivo11,12,13. Per valutare il successo e l’efficienza di queste diverse condizioni di coltura, sono necessarie tecniche per monitorare e stimare il grado di maturazione strutturale di iPSC CM, ad esempio con tecniche microscopiche. A differenza dell’imaging confocale convenzionale, la risoluzione in caso di microscopia fotoattivata di localizzazione (PALM) è di circa 10 volte superiore. Questa tecnica a sua volta consente un’analisi più accurata, rilevando anche sottili alterazioni delle strutture cellulari14. Considerando l’alta risoluzione dell’imaging basato su PALM, l’obiettivo generale di questo metodo era la valutazione microscopica della maturità del sarcomere nei CM derivati da iPSC mediante una determinazione precisa dello spessore z-Disco e della lunghezza del sarcomere. Negli studi precedenti, queste caratteristiche strutturali hanno dimostrato di essere parametri appropriati per valutare la maturità cardiaca15. Ad esempio, iPSC-CM a base di distrofina a lunghezza intera presentano una lunghezza del sarcomere e una larghezza della banda z ridotte rispetto alle celle di tiposelvaggio 16. Allo stesso modo, la lunghezza dei singoli sarcomere è stata misurata per studiare l’impatto dei segnali topografici sullo sviluppo cardiaco16. Quindi, abbiamo applicato questo approccio per valutare la maturazione strutturale della rete sarcomere in iPSC-CM misurando quantitativamente la lunghezza del sarcomere e lo spessore del disco z.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generazione di CM in vitro funzionale derivata da iPSC è importante per le terapie rigenerative, la modellazione delle malattie e lo sviluppo di piattaforme di screening farmacologico. Tuttavia, la maturità insufficiente di questi CM è un ostacolo importante nella ricerca cardiovascolare20. A questo proposito, sono necessarie tecniche di imaging ad alta risoluzione che consentano il monitoraggio dello stato di maturazione strutturale del CM derivato da iPSC. Allo stesso tempo, la microscopia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Fondo strutturale dell’UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Inoltre, H.L. è supportato dal programma FORUN del Rostock University Medical Centre (889001 e 889003) e dalla Fondazione Josef e K’the Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. è supportato dal Programma Scienziato Cliniciano del Rostock University Medical Center. R.D è supportato dal DFG (DA1296/6-1), dalla fondazione DAMP, dalla German Heart Foundation (F/01/12) e dal BMBF (VIP 00240).
Ringraziamo Madeleine Bartsch per il suo supporto tecnico nella coltura cellulare iPSC e nella differenziazione cardiaca.
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
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