Dannelsen av et skikkelig sarcomere-nettverk er viktig for modning av iPSC-avledede kardiomyocytter. Vi presenterer en super oppløsningsbasert tilnærming som muliggjør kvantitativ evaluering av den strukturelle modningen av stamcelleavledede kardiomyocytter, for å forbedre kulturforhold som fremmer hjerteutvikling.
Modningen av iPSC-avledede kardiomyocytter er et kritisk problem for deres anvendelse i regenerativ terapi, narkotikatesting og sykdomsmodellering. Til tross for utviklingen av flere differensieringsprotokoller, er generasjonen av iPSC kardiomyocytter som ligner en voksenlignende fenotype fortsatt utfordrende. Et viktig aspekt ved kardiomyocytter modning innebærer dannelsen av et godt organisert sarcomere-nettverk for å sikre høy sammentrekningskapasitet. Her presenterer vi en super oppløsningsbasert tilnærming for semi-kvantitativ analyse av α-actinin-nettverket i kardiomyocytter. Ved hjelp av fotoaktivert lokalisering mikroskopi en sammenligning av sarcomere lengde og z-plate tykkelse av iPSC-avledet kardiomyocytter og hjerteceller isolert fra neonatal vev ble utført. Samtidig viser vi viktigheten av riktige bildeforhold for å oppnå pålitelige data. Våre resultater viser at denne metoden er egnet til å kvantitativt overvåke den strukturelle modenheten til hjerteceller med høy romlig oppløsning, slik at påvisning av selv subtile endringer i sarcomere-organisasjonen.
Kardiovaskulære sykdommer (CVD) som hjerteinfarkt eller kardiomyopati er fortsatt den viktigste dødsårsaken i den vestlige verden1. Som det menneskelige hjerte har bare dårlig regenerativ kapasitet, det er behov for strategier for å fremme utvinning fra CVDer. Dette inkluderer celleerstatningsterapi for å fylle opp tapte kardiomyocytter (CM), samt utvikling av nye antiarytmiske legemidler for effektiv og sikker farmasøytisk inngrep. Indusert pluripotente stamcelle (iPSC) har vist seg å være en lovende cellekilde for ubegrenset generasjon av human CM in vitro, egnet for regenerative terapier, sykdomsmodellering og for utvikling av legemiddelscreeninganalyser2,3,4.
Selv om mange forskjellige hjertediensiasjonsprotokoller finnes, mangler iPSC-avledet CM fortsatt visse fenotypiske og funksjonelle aspekter som emmer in vitro- og invivo-applikasjonen 5,,6. Ved siden av elektrofysiologiske, metabolske og molekylære endringer innebærer hjertemodningsprosessen den strukturelle organiseringen av sarkomer, som er de grunnleggende enhetene som kreves for kraftgenerering og cellesammentrekning7. Mens voksne CMs viser et godt organisert kontraktilt apparat, viser iPSC-avledede CMs ofte uarrangerte sarcomere-filamenter, forbundet med redusert sammentrekningsevne og endret sammentrekningsdynamikk8,,9. I motsetning til modne CM som viser enaksial sammentrekningsmønster, resulterer de desorienterte strukturene i umodne CM i en radial sammentrekning av hele cellen eller fremmer utseendet på sammentrekningsfokus9,10.
For å forbedre hjertemodning har flere tilnærminger blitt brukt, inkludert 3D-cellekulturmetoder, elektrisk og mekanisk stimulering, samt bruk av ekstracellulære matriser som etterligner in vivoforhold11,,12,,13. For å evaluere suksessen og effektiviteten til disse ulike kulturforholdene, er det nødvendig med teknikker for å overvåke og estimere graden av den strukturelle modningen av iPSC CM, for eksempel ved mikroskopiske teknikker. I motsetning til konvensjonell konfokal avbildning er oppløsningen ved fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM) omtrent 10x høyere. Denne teknikken gir i sin tur en mer nøyaktig analyse, oppdage selv subtile endringer av cellulære strukturer14. Tatt i bruk den høye oppløsningen av PALM-basert bildebehandling, var det overordnede målet med denne metoden den mikroskopiske evalueringen av sarcomere modenhet i iPSC-avledede CMer ved presis bestemmelse av z-Disc tykkelse og sarcomere lengde. I tidligere studier har disse strukturelle egenskapene vist seg å være passende parametere for å vurdere hjertemodenhet15. For eksempel, syk iPSC-CM mangler full lengde dystrophin viser redusert sarcomere lengde og z-band bredde sammenlignet med vill type celler16. På samme måte ble lengden på individuelle sarkomer målt for å undersøke virkningen av topografiske signaler på hjerteutvikling16. Derfor brukte vi denne tilnærmingen til å evaluere den strukturelle modningen av sarcomere-nettverket i iPSC-CM ved kvantitativt måling av sarcomere lengde og z-platetykkelse.
Genereringen av funksjonell iPSC-avledet CM in vitro er viktig for regenerative terapier, sykdomsmodellering og utvikling av legemiddelscreeningplattformer. Imidlertid er utilstrekkelig modenhet av disse CM et stort hinder i kardiovaskulær forskning20. I denne forbindelse er det nødvendig med høyoppløselige bildeteknikker som muliggjør overvåking av den strukturelle modningstilstanden til iPSC-avledet CM. Samtidig kan superoppløsning mikroskopi være et verdifullt verktøy for å nøyaktig …
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av EUs strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). I tillegg støttes H.L. av FORUN-programmet ved Rostock University Medical Centre (889001 og 889003) og Josef og Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. støttes av Clinician Scientist Program ved Rostock University Medical Center. R.D støttes av DFG (DA1296/6-1), DAMP foundation, German Heart Foundation (F/01/12) og BMBF (VIP+ 00240).
Vi takker Madeleine Bartsch for hennes tekniske støtte i iPSC cellekultur og hjertediensiasjon.
human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
Fiji image processing software (Image J) | |||
Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |