Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Fertilitetsbevarelse gennem Oocyte Vitrification: Kliniske og laboratorieperspektiver

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

Oocyte cryopreservation er anerkendt af flere internationale videnskabelige samfund som guldstandarden for fertilitetsbevarelse hos postpubertale kvinder. Passende kliniske strategier og laboratoriestrategier sikrer maksimal effektivitet, effektivitet og sikkerhed ved fertilitetsbevarelsesbehandlinger.

Abstract

Bevarelse af kvinders fertilitet er afgørende i et multifunktionelt sundhedssystem, der tager sig af patienternes fremtidige livskvalitet. Oocyte cryopreservation er anerkendt af flere internationale videnskabelige selskaber som guldstandarden for fertilitetsbevarelse hos postpubertale kvinder, for både medicinske og ikke-medicinske indikationer. De vigtigste medicinske indikationer er onkologiske sygdomme, gynækologiske sygdomme som svær endometriose, systemiske sygdomme, der kompromitterer æggestokkenes reserve, og genetiske tilstande, der involverer for tidlig overgangsalder. Dette papir beskriver hele det kliniske og laboratoriemæssige arbejde med en fertilitetsbevarelsesbehandling ved at skitsere anbefalinger til objektiv og evidensbaseret rådgivning. Desuden fokuserer den på effektiviteten af proceduren og beskriver de mest hensigtsmæssige strategier til fuldt ud at udnytte æggestokkene reserve og maksimere antallet af oocytter hentet på kortest mulig tid. Evalueringen af æggestokkene reserve, definitionen af en ideel stimulation protokol, samt oocyte hentning, denudation, og vitrification procedurer er blevet detaljeret sammen med tilgange til at maksimere deres effektivitet, effektivitet og sikkerhed.

Introduction

Udviklingen og implementeringen af et effektivt kryopræserveringsprogram for humane oocytter har været et betydeligt gennembrud inden for reproduktiv medicin. Ifølge de seneste beviser, vitrification er den mest effektive strategi til cryopreserve metafase II (MII) oocytter, da det resulterer i statistisk højere overlevelsesrater i forhold til langsom frysning, uafhængigt af patientpopulationen (ufrugtbare patienter eller oocyt donation program)1,2,3. De bemærkelsesværdige resultater af oocyt vitrificering førte praksis udvalg American Society for Reproductive Medicine (ASRM) og Society for Assisted Reproductive Technology (SART) til at udtale denne teknik til at være den mest effektive til elektiv fertilitet bevarelse hos postpubertal kvinder, for både medicinske og ikke-medicinske indikationer4,5,6. Medicinske indikationer for fertilitetsbevarelse omfatter (i) kræft og autoimmune sygdomme, der kræver behandlinger7 såsom strålebehandling, cytotoksisk kemoterapi og endokrine terapi (hvis skadelige virkning på æggestokkene reserve er forbundet med moderens alder samt type og dosis af behandlingen); — sygdomme i æggestokkene, der kræver gentagen eller radikal kirurgi (f.eks. endometriose)8 og (iii) genetiske tilstande (f.eks. X-skrøbelige) eller for tidlig ovariesvigt. Derudover er fertilitetsbevarelse blevet en værdifuld mulighed for alle kvinder, der ikke har nået deres forældremål af ikke-medicinske årsager (også kendt som social indefrysning).

Uanset indikationen for fertilitetsbevarelse og i henhold til de store internationale retningslinjer for fertilitetsbevarelse bør alle patienter , der er villige til at vitrificere deres oocytter, modtage passende rådgivning for at blive informeret om deres realistiske chance for succes, omkostninger, risici og begrænsninger ved proceduren9,10,11,12,13. Vigtigst er det, bør det være klart, at vitrifying en kohorte af MII oocytter ikke sikrer en graviditet, men at det giver en større chance for succes for fremtidig in vitro befrugtning (IVF) behandling, hvis det er nødvendigt14. I denne henseende er kvindens alder på tidspunktet for oocyt vitrifikation helt sikkert den vigtigste begrænsende faktor15 som avanceret mødrealder (AMA; > 35 år) er hovedårsagen til kvindelig infertilitet16. Ud over en progressiv reduktion i æggestokkene reserve, AMA er forbundet med en svækkelse af oocyt kompetence på grund af defekte fysiologiske veje såsom stofskifte, epigenetisk regulering, celle cyklus checkpoints, og meiotisk adskillelse17. Derfor afhænger det rimelige antal æg, der skal vitrificeres, hovedsageligt af moderens alder. Hos kvinder yngre end 36 år, mindst 8-10 MII oocytes18 er forpligtet til at maksimere chancen for succes. Generelt gælder det, at jo højere antallet af forglassede oocytter er, jo højere er sandsynligheden for succes. Derfor er skræddersy æggestokkene stimulation i henhold til æggestokkene reserve markører såsom anti-Müllerian hormon (AMH) niveauer eller antral follikeltal (AFC) er afgørende for fuldt ud at udnytte æggestokkene reserve på kortest mulig tid.

Sikkerheden ved hele proceduren er det andet centrale spørgsmål, når du tilmelder patienter til fertilitetsbevarelse. Klinikere bør anvende de bedste strategier til at minimere risici og forebygge (i) ovarie hyperstimulation syndrom (OHSS) ved hjælp af sikre tilgange såsom gonadotrophin-frigive hormon (GnRH) antagonist protokol efterfulgt af en GnRH agonist udløse19 og (ii) fjernbetjeningen, endnu muligt, risiko for peritoneal blødning, skade på bækken strukturer (ureter, tarm, tillæg, nerver), eller bækken infektion under oocyt hentning. Endelig (iii) traditionelle regimer til stimulering er forbundet med supraphysiologic serum østradiol og derfor ikke anbefales i østrogen-følsomme sygdomme som brystkræft. Protokoller, der involverer aromatasehæmmere (f.eks. letrozofødder eller tamoxifen), er mere velegnede i disse tilfælde20,21. I laboratoriet indstilling, den mest udbredte protokol for oocyt vitrification er stadig den første beskrevet af Kuwayama og kolleger2,23, som består af en trinvis procedure, der involverer gradvis tilsætning af kryoprotectants (CPA'er). I første fase (ligevægt/dehydrering) eksponeres oocytter i en CPA-opløsning, der indeholder 7,5% v/v ethylenglycol og 7,5% v/v dimethylsulfoxid (DMSO), mens de i anden fase oocytter flyttes til en vitrifikationsopløsning med 15% v/v ethylenglycol og 15% v/v DMSO plus 0,5 mol/L saccharose. Efter en kort inkubation i vitrifikationsmediet kan oocytterne placeres i specielt designede, åbne kryodevices og til sidst kastes i flydende nitrogen ved -196 °C, der skal opbevares indtil brug.

Her er hele det kliniske og laboratoriemæssige arbejde med en fertilitetsbevarelsesbehandling blevet beskrevet ved (i) at skitsere anbefalinger til objektiv og evidensbaseret rådgivning, (ii) med fokus på procedurens omkostningseffektivitet og (iii) beskrive de mest hensigtsmæssige strategier til fuldt ud at udnytte æggestokkene og maksimere antallet af oocytter hentet på kortest mulig tid. Evalueringen af æggestokkene reserve, definitionen af en ideel stimulation protokol, samt oocyte hentning, denudation, og vitrification procedurer vil blive detaljeret sammen med tilgange til at maksimere deres effektivitet, effektivitet og sikkerhed. Da der findes andre protokoller eller tilpasninger af denne protokol i litteraturen, gælder de repræsentative resultater og diskussionsafsnittene i dette manuskript kun for denne procedure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Op- og 1.3.1992

BEMÆRK: Hvis patienter, der har brug for fertilitetsbevarelse af onkologiske årsager, skal du sikre dig, at der ikke er nogen venteliste til planlægningskonsultation, og at udnævnelsen leveres så hurtigt som muligt.

  1. Undersøg sygehistorien og tidligere dokumentation, og vurder patientens generelle sundhedstilstand.
  2. Registrer alle oplysninger (herunder onkologens godkendelse til at gennemgå stimulering i æggestokkene i tilfælde af kræftpatienter) i en relationel database.
  3. Giv patienten specifik rådgivning om procedurens gennemførlighed. Forklar trinene i proceduren (ovariestimulering, oocytudtagning, oocyt vitrificering) og informere hende om de realistiske chancer for succes (hovedsagelig afhængig af moderens alder og forventet antal MII oocytter på tidspunktet for oocytudtagning) samt omkostningerne og begrænsningerne ved proceduren.
  4. Udfør transvaginal ultralyd for at få oplysninger om æggestokkene reserve (dvs. AFC) og til at vurdere tilgængeligheden af æggestokkene til ægopsamling.
  5. Anmod om blodprøver for at vurdere blodgruppen og Rhesus-faktoren, koaguleringsscreening (blodtælling, prothrombin, thromboplastin, fibrinogen, protein C, protein S, anti-thrombin III, homocystein) og smitsomme sygdomme (Hepatitis B, Hepatitis C, HIV, Venereal Disease Research Laboratory/Treponema pallidum Hemagglutination Assay).
    BEMÆRK: I tilfælde af patienter, der får adgang til et fertilitetsbevaringsprogram af ikke-presserende medicinske årsager, kan en mere omfattende vurdering omfatte basal follikelstimulerende hormon (FSH), luteinizing hormon (LH), østradiol, AMH, brystundersøgelse, Papanicolaou-test, genetisk screening af koagulation (faktor V i Leiden og prothrombin) og TORCH-screening (toxoplasmose, røde hunde, cytomegalovirus).
  6. Anmod om en kardiologisk vurdering (elektrokardiogram).
  7. Anbefal psykologisk rådgivning.

2. Kontrollerede protokoller for stimulering af æggestokkene til fertilitetsbevarelse

BEMÆRK: Når den tid, der er til rådighed, før kræftbehandlingen påbegyndes, er begrænset, anbefales den tilfældige startprotokol (dvs. start af stimulering af æggestokkene til enhver tid under menstruationscyklussen) til ovariestimulering hos onkologiske patienter, der er kandidater til fertilitetsbevarelse. I en fertilitet bevarelse program for ikke-presserende medicinske årsager eller sociale årsager, konventionelle stimulation starter i den tidlige follikulær fase er at foretrække, og æggestokkene stimulation er startet baseret på menstruationscyklus. Kontrollerede metoder til stimulering af æggestokkene (COS) bør udføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE)24.

  1. Skræddersy COS i henhold til patientens egenskaber og æggestokkene reserve markører, primært moderens alder, FSH, AMH, og AFC.
  2. Start COS på dag 5 i menstruationscyklussen ved hjælp af rekombinant eller urin FSH med en fast dosis på 150-300 IE/dag (antagonistprotokol).
    BEMÆRK: I en bestemt patientpopulation med LH-mangel eller dårlig suboptimal respons kan yderligere LH 75/150 IE/dag administreres i henhold til æggestokkenes respons, LH-niveauer og gynækologens vurdering.
  3. Hos patienter med østrogen-følsomme sygdomme, omfatter gonadotropiner forbundet med aromatase hæmmere (letrozol) fra dag 1 af stimulation indtil dag 7 efter oocyt hentning.
  4. Administrere en fast dosis gonadotropiner i 4 dage.
  5. Overvåg follikulær vækst på dag 5 og derefter hver 2-3 dage; til sidst, justere gonadotropin dosis.
  6. Når mindst 3 follikler når 17-18 mm i diameter, skal der gives udløseren til endelig oocytmodning med en enkelt subkutan bolus af GnRH-agonist ved dosis på 0,5 mL.

3. Oocyte-hentning

  1. Forberedelse til oocythentning
    1. For nødvendige materialer henvises til tabellen over materialer, og hold klar laboratoriefodtøj og outfit, kirurgisk ansigtsmaske, hårdæksel, kirurgiske handsker, en permanent ikke-giftig markør, pincet, sterile små gazer, engangs eller genanvendeligt speculum, vaginal kirurgi udstyr og overflade desinfektionsmiddel. Sørg for tilgængeligheden af genoplivningsudstyr, bedøvelsesmidler til vending, et sæt forberedt til behandling af anafylaktisk stød og ilt i operationsstuen.
    2. Udførelse af oocytudtagningsproceduren i overensstemmelse med anbefalingerne fra ESHRE-arbejdsgruppen om ultralyd i assisteret reproduktionsteknologi (ART)25.
      1. Administrere sedation eller generel anæstesi, og antibiotika til profylakse.
        BEMÆRK: I denne protokol blev dyb sedation opnået ved at administrere propofol (hvis dosering justeres i henhold til patientens vægt) og 50-100 μg fentanyl, 1000 mg paracetamol og assisteret maskeventilation med ilt.
      2. Udfør oocytudtagning ved hjælp af en aspirationsenhed bestående af en vakuumpumpe, et opsamlingsrør, der er forbundet til en 17 G single-lumen-nål, og et oocytopsamlingsrør. Under indsamlingen må du ikke overskride et tryk på ~ 120 mmHg for at undgå risikoen for skade på oocytterne, såsom stripning af cumuluscellerne eller brud på zona pellucida.
      3. Arbejdsfladetemperaturen kalibreres for at sikre 37 °C i dyrkningsmediet. Under hele proceduren skal du minimere oocyteksponering for selv forbigående temperatur, der kan påvirke deres udviklingskompetence.
      4. Ved slutningen af oocytudtagning skal patienten observeres i 3-4 timer før udledning.
  2. Operationsteater
    1. Før du går ind på operationsstuen, skal du identificere patienten og bekræfte tidspunktet for ægløsningsudløseren.
    2. Få patienten til at lægge sig på operationsbordet i gynækologisk position.
    3. Rens skeden / livmoderhalsen før oocyt hentning for at minimere bakteriel forurening.
    4. Udfør en foreløbig transvaginal ultralyd for at vurdere æggestokkenes position og de anatomiske forhold til de forskellige organer og blodkar.
    5. Under ultralyd vejledning, indsætte en enkelt-lumen nål gennem vaginal væggen og ind i en æggestokkene follikel, passe på ikke at skade organer eller blodkar placeret mellem vaginal væggen og æggestokken.
    6. Start aspiration fra den nærmeste follikel og gå videre til de mest distale.
    7. Punkter alle follikler med en diameter på over 11-12 mm, der udfører "vridningsbevægelser" af nålen for at suge hele follikulærvæsken, som derefter frigives til et sterilt rør (rund bund 14 mL) forvarmet i blokvarmeren i operationsstuen.
    8. Umiddelbart efter hentning, forsegle og mærke røret med oplysninger om patientens identitet.
    9. Sørg for, at sygeplejersken bringer røret til laboratoriet, hvor det straks screenes for tilstedeværelsen af cumulus-oocytkomplekser (COCs).
    10. Instruer embryologerne om at informere klinikeren om det samlede antal hentede COC'er.
    11. Når proceduren er afsluttet for den første æggestok, skyl nålen med rent medium, og fortsæt med den anden æggestok ved hjælp af samme procedure.
    12. Efter oocytudtagning skal du evaluere eventuelle blødninger fra æggestokkene eller blodkarrene i parametriet og fri væske i Douglas' pose.
      BEMÆRK: For at automatisere og forbedre effektiviteten af sporbarhed af gameter og embryoner på klinisk niveau blev der implementeret et elektronisk vidnesystem (EWS) i centrum26. Ikke desto mindre nævner denne protokol ikke EWS for at sikre protokollens reproducerbarhed i noget IVF-laboratorium. Men mener, at alle trin i proceduren kræver en anden operatør (dvs. et vidne) for at sikre gamet og embryo sporbarhed.

4. IVF laboratorium

  1. Dagen før oocythentningsproceduren
    1. Forbered oocytopsamlingsrør (se materialetabellen).
      1. 1 mL IVF-medium (se materialetabellen)udleveres i hvert oocytopsamlingsrør (rund bund, 5 mL) og dækkes med 0,2 mL mineralsk olie (se materialetabellen)til embryokultur.
        BEMÆRK: Antallet af rør vil blive defineret i henhold til antallet af follikler, der forventes at blive hentet. Hvert rør kan indeholde op til 4 COC'er.
    2. Forsegl rørene med hætten (første snap). Mærk rørene med oplysninger om typen af medium og fremstillingsdato. Rørene inkuberes natten over ved 37 °C i kontrolleret atmosfære (6% CO2, 5% 02).
  2. På dagen for oocyte-hentning
    1. Før krigen forsynes plasten ved 37 °C (sterile kulturretter og Pasteur-pipetter).
    2. Bed patienterne om at bekræfte deres identitet (fulde navn og fødselsdato) og tidspunktet for ægløsningsudløseren. Anmærke på laboratoriearket, at identifikationsproceduren (ID) er udført, og at tidspunktet for ægløsningsudløseren er blevet bekræftet.
    3. Tag oocytopsamlingsrørene af inkubatoren (lige før proceduren begynder), og tryk hætten ned for at sikre tæt lukning. Mærk oocytsamlingsrørene med patientens oplysninger. Oocytopsamlingsrørene anbringes i blokvarmeren ved 37 °C.
    4. Undersøg follikulærvæsken i de førvarmede sterile kulturretter, og identificer COC'er. Når en eller flere COC'er er identificeret, skylles de to gange i to dråber medium for at fjerne follikulærvæsken og blodforureningen.
    5. Overfør COC'erne til oocytopsamlingsrørene, og anmærke antallet af COC'er på røret. Hætterne på mediumrørene løsnes straks ved 37 °C i en atmosfære på 6 % CO2, 5 % O2.
    6. Gentag trin 7 til 9 i overensstemmelse med antallet af hentede oocytter. Opdater laboratoriearket.
      BEMÆRK: Sørg for, at et vidne kontrollerer, at alle røropvarmningsblokkene (herunder dem i operationsstuen) er tomme, og underskriver lukningen af proceduren på laboratoriearket.
    7. Tør arbejdsfasen af efter procedurens afslutning.

5. Oocyte-denudation

  1. Prewarm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES)-buffered medium og hyaluronidase (se materialetabellen) ved 37 °C mindst 1 time før start.
  2. Forbered en 4-brønds IVF plade (se tabellen over materialer) med 0,6 mL/brønd af prewarmed HEPES-buffered medium (suppleret med 5% human serum albumin [HSA]) dækket med 0,3 mL mineralsk olie til embryokultur, og varm ved 37 °C i mindst 30 min.
  3. Mærk oocytafslationspladen med oplysninger om patientens identitet.
  4. Umiddelbart før proceduren påbegyndes, tilsættes hyaluronidase til den første brønd for at opnå en endelig koncentration på ca. 20 IE/mL.
  5. Placer et begrænset antal COC'er (op til 6) i den første brønd, der indeholder enzymet, for at sprede cumuluscellerne.
  6. For at forbedre enzymatisk fjernelse af cumulus og koronaceller skal du udføre stripning af cumulusceller ved at pipettere oocytterne gentagne gange gennem en Pasteur-pipette med en indvendig diameter på ca. 250 μm i op til 30 s. Når den første celleafkobling er observeret, overføres oocytterne til den anden brønd, der kun indeholder HEPES-bufferet medium, idet man sørger for at overføre en minimumsmængde af enzymet.
  7. Udfør yderligere denudation for at fjerne koronacellerne ved at bruge denuding af pipetter med faldende indvendige diametre (170-145 μm). Brug kun lavere diametre (135μm), hvis det er strengt nødvendigt.
  8. Vask forsigtigt de denuded oocytter for at vaske enzymet ud.
  9. Efter denudation undersøges oocytterne under et omvendt mikroskop for at vurdere deres integritet og modningsstadium. Der adskilles MII-oocytter fra de umodne (germinal vesikel og metafase-I).
  10. Flyt MII oocytterne til vitrifikationsområdet for straks at udføre kryopræservering. Opdater laboratoriearket.

6. Oocyte vitrifikation

BEMÆRK: Udfør oocyt vitrifikation helst inden for 38 timer efter oocytudtagning og umiddelbart efter denudation. Den her beskrevne vitrificeringsprocedure skal udføres ved stuetemperatur (RT) og ved hjælp af en stripperpipette med en indvendig diameter på 170 μm for ikke at beskadige oocytter under manipulation.

  1. Ca. 30 minutter før proceduren bringes ækvilibreringsopløsningen (ES) og vitrifikationsopløsningen (VS) til RT (25-27 °C).
  2. Korrekt mærke cryodevices med patientens navn og ID, behandling ID, dato for frysning, antal oocytter, og kryobarkode.
  3. Fyld et engangskølestativ op til toppen med frisk flydende nitrogen, og start steriliseringsprocessen.
  4. Mærk vitrifikationspladen (se materialetabellen) med patientens navn og ID. Bed et vidne om at kontrollere kryodevices korrekte ID.
  5. Vend forsigtigt hvert hætteglas to gange for at blande indholdet før brug, og forbered låget på en 6 mm petriskål med en dråbe på 30 μL HEPES-buffermedium (med 5% HSA) og en tilstødende dråbe på 30 μL ES.
    BEMÆRK: Placer dråber lige før brug for at begrænse medium fordampning.
  6. Ved hjælp af en stripperpipette med en diameter på 170 μm placeres oocytterne (op til 9) i det første fald med det mindst mulige volumen af medium. Ved hjælp af stripperpipetten skal der skabes en bro af medium mellem dråben n.1 og n.2 for at opnå en gradvis stigning i koncentrationen af CPA'erne (Figur 1A).
  7. Inkubat oocytterne i det første fald i 3 minutter. Der tilsættes en tredje dråbe 30 μL ES (n.3). Efter 3 min overføre oocytterne til den anden dråbe ES, og skabe en medium bro mellem dråber n.3 og n.2 (Figur 1B). Inkuber oocytterne i drop n.3 i 3 min.
  8. Under inkubationen tilsættes en 30 μL dråbe ES for hver kryodevice, der skal anvendes (hvis 9 oocytter skal kryopreserveres, skal du placere 3 dråber ES med 3 oocytter i hver dråbe ES). Flyt oocytterne til ren ES-opløsning, og lad dem stå i 6-9 minutter (indtil de genvinder deres oprindelige størrelse efter svind)(Figur 1C).
  9. Forbered en central brønd skål (60 x 15 mm) med 1 mL VS. I slutningen af de første 6 minutter overføres oocytterne, der skal kryopreserveres, til VS-opløsningen og frigives så lidt medium som muligt. Lad oocytterne stå i VS i 1 min. og vask dem forsigtigt ved at flytte dem fra bunden til toppen af skålen for at fjerne overskuddet af ES.
  10. Ca. 10 s inden udgangen af det minut af inkubation, placere kryodevice under mikroskopet, og justere fokus på det sorte mærke (dvs. spidsen af cryodevice). Placer oocytterne på kryodevicen ved siden af det sorte mærke med den mindste mængde VS (Figur 2A).
  11. Flyt stripperpipetten væk fra oocytterne, og fjern overskuddet af VS-medium (Figur 2B), så oocytterne forbliver dækket af et tyndt lag medium (Figur 2C).
  12. Smid hurtigt kryodevicen i flydende nitrogen, ryst den hurtigt for at fjerne luftbobler fra overfladen. Hold kryodevicens beskyttende hætte med pincet, og fyld den med flydende nitrogen; derefter indsætte kryodevice i det og samtidig holde propylen strimler i flydende nitrogen.
  13. Gem kryodevicen i et visiotube, der tidligere var mærket med patientens oplysninger. Opdater laboratoriearket.

7. Oocyte opvarmning

  1. Ca. 30 minutter før proceduren opvarmes optøningsopløsningen (TS), fortyndingsopløsningen (DS) og vaskeopløsningen (WS) til RT (25-27 °C). Vend forsigtigt hvert hætteglas to gange for at blande indholdet. Der anbringes 1 mL TS i en central brønd Petriskål, og den opvarmes ved 37 °C i mindst 1 time, før proceduren påbegyndes.
  2. Mærk alle plastforsyninger med patientens navn og ID og typen af opløsning. Bed et vidne om at bekræfte patientens oplysninger om kryodevicen.
  3. For hver kryodevice, der skal opvarmes, forberede en 6-brønds plade med 200 μL DS i den første brønd og en lige stor mængde WS i den anden og tredje (navngivet WS1 og WS2, henholdsvis). Tilsæt fosfat buffered saltvand (PBS) eller sterilt vand i området uden for brøndene for at forhindre fordampning.
  4. Tag TS-skålen ud fra inkubatoren, og læg den under mikroskopet. Juster mikroskopets fokus til midten af petriskålen.
  5. Drej forsigtigt og fjern kryodevicens beskyttende hætte, mens propylenstrimlerne opbevares i flydende nitrogen. Kryodevicen overføres fra flydende nitrogen til TS så hurtigt som muligt for at undgå risikoen for devitrificering og starte nedtællingen (1 min).
  6. Lokalisere oocytter ved at fokusere på spidsen af cryodevice (dvs. det sorte mærke). Brug en stripper pipette, slip oocytter fra cryodevice.
    BEMÆRK: Prøv ikke at suge oocytterne ud af kryodevicen; forsigtigt frigive nogle medier på dem, indtil de flytter ind i TS.
  7. Ved hjælp af en stripperpipette med en diameter på 170 μm overføres oocytterne til DS med en lille mængde TS (for at skabe en gradient), og lad dem stå i DS i 3 min. Flyt oocytterne til WS1 på samme måde, og lad dem stå i 5 min. Til sidst overføres oocytterne til WS2 i 1 min.
  8. Overfør oocytterne til et passende prækomlibreret IVF-dyrkningsmedium, og inkuber dem i 1 time, før de fortsætter med intracytoplasmisk sædindsprøjtning (ICSI). Opdater laboratoriearket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oversigt over fertilitetsbevarelsesprogrammet på centret

Over en 12-årig periode (2008-2020) gennemgik 285 kvinder mindst én oocytudtagning, der indebar vitrificering af hele kohorten af modne æg indsamlet. De fleste af disse kvinder (n= 250) gennemgik en enkelt genfinding, og 35 gennemgik flere henninger. Årsagerne til at gennemgå oocyt hentning for æg vitrification er sammenfattet i 4 kategorier: medicinsk (bortset fra kræft), kræft, ikke-medicinsk, og andre. Blandt de 250 kvinder, der gennemgår en enkelt oocytudtagning til ægglasning, havde 8% andre medicinske årsager end kræft (10 endometriose, 3 myoma, 4 cyster i æggestokkene, 1 hydrosalpinx), 16% havde kræft (31 brystkræft, 3 kræft i æggestokkene, 2 kolorektal cancer, 2 Hodgkins lymfom, 1 vulvar kræft e 1 livmoderhalskræft), 53% havde ikke-medicinske årsager, og 23% havde andre grunde (43 fravær af sæd hentet, 10 risiko for OHSS, 4 infektioner, og 1 feber). Denne fordeling var forskellig blandt patienter, der gennemgik flere oocytudtagninger til ægglasning. Specifikt havde 9% andre medicinske årsager end kræft (1 endometriose, 2 reduceret æggestokkene reserve), 6% havde kræft (2 brystkræft), 80% havde ikke-medicinske årsager, og 3% havde andre grunde (1 fravær af sæd hentet). Ingen af de patienter, der gennemgik flere oocytudtagninger til æggæring, opvarmede disse æg, mens 78 af de 250 kvinder, der gennemgik en enkelt æg-vitrifikationscyklus, vendte tilbage for at bruge disse oocytter (figur 3).

Tabel 1 giver en oversigt over data fra de 250 kvinder, der gennemgår en enkelt oocyt vitrifikationscyklus, der er grupperet efter de dertil knyttede årsager. Patienterne med en medicinsk grund til æg vitrifikation og patienter, der gennemgår fertilitetsbevarelse på grund af kræft var yngre (gennemsnitlig mødrealder < 35 år) og viste en bedre æggestokkene reserve (højere AFCs) end patienter med ikke-medicinske eller andre årsager. De gennemsnitlige modningsrater (antal MII-oocytter/antal hentede COC'er) var imidlertid lidt lavere (72-73% mod 77-79%), således at antallet af oocytter, der i gennemsnit var præget af, var det samme i de 4 grupper (9-10 oocytter). Det er vigtigt, at 9 ud af 40 onkologiske patienter (22,5 %) gennemgik en tilfældig-start-stimuleringsprotokol på æggestokkene, fordi de havde begrænset tid, før de startede kemo- eller strålebehandling. Det er interessant, at ca. halvdelen af patienterne med andre medicinske årsager end kræft (53%) og de fleste patienter med andre årsager til æg vitrifikation (76%) faktisk vendte tilbage til opvarmning. Omvendt brugte meget få patienter, der gennemgik fertilitetsbevarelse for kræft (17,5%) eller ikke-medicinske årsager (13%), deres forglassede oocytter til IVF. Også bemærkelsesværdigt er den tid, der er gået mellem vitrificering og opvarmning blandt de patienter, der vendte tilbage: i gennemsnit 283 dage hos patienter med andre medicinske årsager end kræft, 132 dage hos patienter med andre grunde, 1264 dage hos onkologiske patienter og 1547 dage hos patienter med ikke-medicinske årsager. Uanset alle disse relevante forskelle var overlevelsesraten ens (83-88%; i gennemsnit blev 8-11 oocytter opvarmet, og 7-9 oocytter overlevede) mellem patienterne i de 4 grupper, hvilket bekræftede effekten og sikkerheden af oocyt vitrificerings- og opvarmningsprotokoller. Desuden er overlevelsesraten uafhængig af vitrificering og opvarmningsoperatørens erfaring (figur 4A, B). Tabel 1 viser befrugtningsraterne i de 4 grupper, som er ~70%, bortset fra patienter med ikke-medicinske årsager til oocyt vitrifikation (~80%). Disse data er dog ikke sammenlignelige på grund af en lille prøvestørrelse og sædfaktorens bias på befrugtningsresultatet27.

Figure 1
Figur 1: Medium dråbekonfiguration til oocyt kryopræservering. For gradvist at kunne foretage ekvilibrering placeres oocytter først i en (A) dråbe BS og blandes med (B) en dråbe ES. Efter 3 minutters inkubation blandes (C) en tredje dråbe ES-opløsning, og oocytter inkuberes i 6-9 min. Forkortelser: HEPES = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; BS = HEPES-buffermedium; ES = ækvilibreringsopløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2:Oocyte belastning på kryopræservering enhed. Oocytterne placeres på kryodevicen i (A) en enkelt lille dråbe VS. (B) Stripperpipetten flyttes væk fra oocytterne, og (C) overskuddet af VS suges igen for at efterlade bare et tyndt lag omkring hver oocyt. Forkortelse: VS = vitrifikationsopløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3:Oocyte vitrifikationscyklusser udført på GENERA center for reproduktiv medicin i Rom (år 2008-2020). I løbet af den 12-årige periode gennemgik 250 patienter en enkelt oocytudtagning til oocyt vitrificering, mens 35 gennemgik flere oocytudtagningscyklusser. De iboende årsager til oocyt vitrifikation er vist i figuren. De patienter, der vender tilbage til opvarmning (n = 78) tilhører kun den gruppe af kvinder, der gennemgik en enkelt oocyt vitrifikation cyklus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4:Gennemsnitlig overlevelsesrate pr. kohorte af opvarmede oocytter. (A) Vitrificering og (B) opvarmning af operatørernes erfaringer. Hver patient er kun inkluderet i den første opvarmningscyklus. Statistisk signifikante forskelle blev vurderet ved hjælp af Mann-Whitney U-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5:Oocytmorfologi i begyndelsen og slutningen af ækvilibreringsproceduren. For at bestemme resultatet af ækvilibreringsproceduren kan det være nyttigt at anmærke (A) oocytmorfologi, før proceduren påbegyndes. (B) Der observeres en kraftig svind af oocyten efter første eksponering for kryobeskyttende opløsning. Ækvilibreringsproceduren kan betragtes som afsluttet, når (C) oocyten har genvundet sin oprindelige mængde. Skalalinjer = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Årsag til oocyt vitrifikation Anden medicinsk end kræft (n=19) Kræft (n=40) Ikke-medicinsk (n=133) Andet (n=58)
Moderens alder på oocyt hentning, betyder±SD 33,6 ±6,4 år 34,6 ±5,9 år 37.0±3.4 år 38.2±4.3 år
Basal FSH, middelværdi±SD 7.5±4.2 IE/L 7.6±1.7 IE/L 7.8±4.1 IE/L 8.8±5.2 IE/L
AMH, middelværdi±SD 1.8±1.7 ng/mL 1.9±0.2 ng/mL 2.2±2.4 ng/mL 3.0±2.5 ng/mL
AFC, middelværdi±SD 12.7±5.0 13.3±7.0 11.6±6.1 10.7±6.7
BMI, middelværdi±SD 20.1±1.5 21,8±1,6 20.2±3.1 22,9 ±3,6
Varighed af stimulering, middelværdi±SD 10.0±1.5 9.6±1.7 9.9±2.1 10.3±2.1
9/40, 22.5%
Tilfældig start
COC'er, i alt, middelværdi±SD 239 551 1493 592
12.6±5.3 13.8±9.1 11.2±7.1 10.2±8.5
MII oocytter, total, middelværdi±SD 167 400 1161 462
8.8±3.3 10.0±7.2 8.7±5.7 8.0±6.7
Modningshastighed, middelværdi±SD 72,4±13,6% 72,1±19,6% 79,5±17,5% 77,4 ±22,2%
Patienter, der vender tilbage til opvarmning, i alt % af de patienter, der har gennemgået 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
Dage mellem vitrificering og første opvarmning, middelværdi±SD 283±225 1264±764 1547±709 132±203 (±3)
Opvarmede MII oocytter, total middelværdi±SD 82 66 191 409
8.2±2.8 9.4±4.8 11.2±5.8 9.3±7.2
Overlevede MII oocytes, total gennemsnitlig±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7.9±4.0 9.4±4.8 7.8±6.9
Overlevelsesrate, middelværdi±SD 87,6±18,1% 83,2±1,7% 85,4% ±14,5% 84,7±21,9%
Sædfaktor
N, n, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
Pengemarkedsforening, n, % 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
HAVRE, n, % 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, n, % - - - 3/44, 7%
Befrugtningshastighed, middelværdi±SD 70,0±14,4% 70,0±17,0% 78,5 ±20,6% 71,0±24,3%

Tabel 1: Patienter, der gennemgår en enkelt cyklus af oocyt vitrifikation. Forkortelser: FSH = follikelstimulerende hormon; AMH = anti-Müllerian hormon; BMI = body mass index; COC = cumulus oocyte komplekser; MII = metafase II; N = normozoospermic; MMF = moderat mandlig faktor (1-2 sæddefekter); OAT = oligo somnoteratozoospermic; NOA = ikke-obstruktiv azoospermi (sæd blev indsamlet gennem testikel sædudvinding).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kliniske overvejelser

Selv om nye strategier, såsom æggestokkene væv cryopreservation og in vitro modning, er blevet undersøgt, oocyt vitrification efter COS er guld standard teknik til fertilitet bevarelse. I dette scenario, antallet af oocytter hentet og cryopreserved bør maksimeres på kortest mulig tid, da de fleste kræftpatienter kan drage fordel udelukkende af en æggestokkene cyklus, før de er nødt til at påbegynde deres kræftbehandling (r). Således er en ordentlig æggestokkene stimulation protokol afgørende for fuldt ud at udnytte æggestokkene reserve og øge den kumulative chance for en fremtidig levende fødsel28, et resultat stærkt afhængig af moderens alder på oocyt hentning. I denne forbindelse er der endnu ikke foreslået en ideel alder for oocyt vitrificering til fertilitetsbevarelsesformål29, og der kræves konsensus mellem enten 35 årog 37 år30,31. Fertilitetsbevarelse bør dog være tilgængelig for alle patienter, herunder kvinder over 37 år, forudsat at de får ordentlig rådgivning om succesraterne baseret på deres alder.

Protokollen og startdosis af medicin skal skitseres i henhold til gynækologens dom og vigtigst af alt, baseret på den tilgængelige tid32,33. Det anbefales at starte konventionel stimulering i den tidlige follikulære fase, når tiden ikke er et problem. Men hvis det kræves, random-start tilgang er muligt at minimere forsinkelser i påbegyndelse af akut kræft / medicinske behandlinger34,35. Follikulær udvikling er blevet rapporteret at være en yderst dynamisk proces som flere bølger af follikel rekruttering er blevet beskrevet i hele en enkelt æggestokkene cyklus. Selv om de biologiske mekanismer bag dette fænomen stadig mangler at blive afsløret, kompetente oocytter kan hentes og kryopreserveret uafhængigt af den fase af menstruationscyklus, hvor COS er startet36.

I dette center, er æggestokkene stimulation typisk udføres ved hjælp af GnRH antagonist protokol og 150-300 IE/day for rekombinant-FSH eller menneskelige menopausale gonadotropin. I specifikke populationer af patienter over 35 år, med LH-mangel, eller viser suboptimal respons efter standard COS, LH kan tilføjes under COS for at øge rekruttering og vækst af follikler gennem en synergisk handling med insulin-lignende vækstfaktor 116,37,38. Desuden gnrh antagonist protokol efterfulgt af en GnRH agonist udløser er blevet rapporteret at være en kort, sikker og meget bekvem stimulation protokol for at maksimere æggestokkene respons og minimere risikoen for OHSS39. Hos patienter med østrogenfølsomme sygdomme som brystkræft administreres gonadotropiner forbundet med aromatasehæmmere, såsom letrozol,20.

Faktisk viste en nylig gennemgang, at letrozofler involverer lignende ovarierespons som konventionel stimulation uden komplikationer med hensyn til medfødte defekter, malignitetsgentagelse og øgetdødelighed 40. Tilsvarende kan tamoxifen anvendes under COS i tilfælde af østrogen-følsomme tumorer, der ligesom letrozel, viste ingen indvirkning på oocyt kompetence41,42. Dette skal dog bekræftes i større undersøgelser. I dette center administreres letrozole fra dag 1 af stimulering op til dag 7 efter oocytudtagning i tilfælde af østradiolfølsomme tumorer. Risikoen for OHSS, som er den vigtigste komplikation af COS, som også yderligere ville forsinke kræftbehandlinger, bør overvejes, især hos unge patienter med høje AFC'er. I disse tilfælde har udløse ægløsning med en GnRH agonist i stedet for menneskelige chorionic gonadotropin (hCG) vist sig at være gavnligt. Andre spørgsmål, der skal forebygges, er (i) trombo-emboli, som kræver administration af lav-molekylvægt heparin under COS, og (ii) en reduceret æggestokkene respons efter COS43. For at kompensere for sidstnævnte, to på hinanden følgende stimuleringer i en enkelt æggestokkene cyklus kan udføres. Denne nye ukonventionelle COS protokol, kendt som DuoStim, indebærer follikulær og luteal fase stimulationer og to oocyte hentning inden for en kort tidsramme (~ 15 dage) og bør undersøges for fertilitetsbevarelse formål i fremtiden44,45,46.

Andre mulige strategier for fertilitetsbevarelse hos kvinder er: (i) æggestokkene væv cryopreservation, som er den eneste mulighed for præubertale kvinder. Denne mulighed er lovende for at genoprette reproduktiv og endokrine aktivitet og undgå forsinkelse i at starte kræftbehandling som ingen hormonel stimulation er nødvendig. Det er dog stadig eksperimentelt og kræver laparoskopisk kirurgi med senere transplantation, og der er risiko for genafsendelse af ortopisk kræft. (ii) Embryo cryopreservation, som indebærer en højere overlevelsesrate efter opvarmning, men forsinker kræftbehandling og kræver, at en mandlig partner eller donor skal involveres, hvilket også begrænser en kvindes fremtidige reproduktive autonomi47. Desuden kan det være underlagt juridiske begrænsninger i nogle lande. I betragtning af disse begrænsninger betragtes oocyt vitrificering som den mest etablerede og etisk acceptable tilgang. Ideelt set bør alle større hospitaler, hvor kvinder ramt af kræft i deres reproduktive alder behandles, give programmer for fertilitetsbevarelse, og hele processen bør være gratis for disse patienter at sikre lige adgang til dette program. Alligevel skal oocyt kryopræservering udføres udelukkende i centre med tilstrækkelig ekspertise til ikke at påvirke oocytkompetence i processen48.

Kritiske trin i vitrificeringsprotokollen og fejlfinding

Vitrificering er en pseudo andenrangs fase overgang (IUPAC Kompendium af kemisk terminologi), der fremkalder en glas-lignende størkning inde i cellerne forhindrer is krystal kerner og vækst, den vigtigste årsagsfaktor for celleskade. For at opnå korrekt vitrifikation kræves en kombination af mindst to CPA'er (typisk ethylenglycol og DMSO som gennemtrængningsmidler og saccharose som det ikke-gennemtrængende middel) sammen med en ekstremt høj kølehastighed (>20.000 °C/min), der opnås enten ved at minimere belastningsmængderne eller ved direkte eksponering af prøverne for flydende nitrogen (åbne enheder). Da oocytter er de største celler i kroppen, indeholder de den største mængde vand. Derfor er de mere følsomme over for fryseskader end embryoner. Under oocyt kryopræservering kan skader på intracellulære organeller (f.eks. cytoskelet eller meiotisk spindel), ændring af membranpermeabilitet, zona pellucida hærdning, oocytaktivering, ændring af de biokemiske veje og muligvis celledød forekomme49. Derfor skal der sikres en hårfin balance mellem flere faktorer for en vellykket bevarelse af oocytens levedygtighed og udviklingskompetence. For at opnå konsekvens i overlevelsesraten efter vitrificeringen og nå benchmarkniveauerne skal alle de afgørende trin i proceduren kontrolleres nøje.

CPA'er, celle osmolalitet og kølehastigheder

For at øge sandsynligheden for vitrificering skal viskositeten af mediet (og dermed CPA-koncentrationen) maksimeres. CPA'ernes toksicitet bør dog altid holdes under kontrol50. Til dette formål er det afgørende at minimere både tidspunktet for celleeksponering for CPA'erne og lastemængderne og altid arbejde ved stuetemperatur (25-27 °C)51. Andre protokoller omfatter forskellige kombinationer af CPA'er og kryodevices og udføres ved 37 °C. De er dog ikke blevet beskrevet her. Noterne, de repræsentative resultater og diskussionsafsnittene i dette manuskript gælder således kun for den vitrifikationsprotokol, der er beskrevet her.

Under kryopræservering udsættes oocytterne for CPA-opløsninger af øget osmolytkoncentration for at fremme celledehydrering og cytoplasmisk svind. Under opvarmning udsættes de for opløsninger med nedsat osmolytkoncentration for at genoprette det cytoplasmiske volumen. Under vitrifikation dehydreres oocytterne, og utilsigtede udsving i cellevolumen kan forårsage alvorligt osmotisk chok og derved kompromittere overlevelse og udviklingspotentiale efter opvarmning52. At finde den optimale kølehastighed er et centralt aspekt for at bevare cellegabiliteten, da det påvirker osmolaliteten53 og celleudviklingspotentialet54. For eksempel, når en celle udsættes for kølehastigheder langsommere end de optimale hastigheder, kan den i vid udstrækning udsættes for hypertoniske tilstande, der fører til celledød.

For at opnå den optimale kølehastighed bør belastningsmængderne minimeres, RT skal kontrolleres for ikke at påvirke ækvilibreringsprocessens hastighed, og prøverne bør være direkte udsat for flydende nitrogen. En måde at vurdere, hvornår ækvilibrering er opnået, er at kommentere oocyttens morfologi (især bredden af perivitellinerummet og tykkelsen af zona pellucida) inden procedurens begyndelse (Figur 5A). Efter en indledende fase af reduktionen af cellevolumen (figur 5B) forventes oocyten at genvinde sin oprindelige mængde (Figur 5C). Selv om korrekt pH opretholdes under oocythåndtering under luftatmosfære på grund af zwitterionerne, der bufferer vitrifikationsopvarmningsopløsningerne, er medium osmolalitet i stedet særligt afhængig af temperatur53. Derfor er metoden til skålforberedelse afgørende for at reducere eventuelle skadelige virkninger55.

Olie overlay er helt sikkert afgørende for at forhindre fordampning og undgå enhver stigning i osmolalitet i IVF medier56. Det kan dog ikke bruges, mens vitrificerings- og opvarmningsprocedurerne udføres. Derfor er nogle tips vigtige for operatørerne: (i) forberede dråberne så hurtigt som muligt og umiddelbart før brug; — overveje større mængder dråber for at minimere forskydninger i svingmolaritet (<30 μL anbefales ikke) iii) når miljøforholdene ikke kan standardiseres, kan der anvendes en 6-brønds plade, og der kan tilsættes sterilt vand eller PBS til det tilstødende reservoir for at begrænse fordampningen iv) være opmærksom på datoen for den første åbning af mediumglasset, da osmolalitet kan ændre sig, hvis flasken åbnes gentagne gange.

Oocyte opvarmning og oocyt afvitrification

Det mest afgørende skridt, der kan påvirke konsistensen i overlevelsesraten, er bestemt opvarmningsprocessen57. I dette trin fjernes CPA'er gradvist fra oocyten og fortyndes for at forhindre enhver potentiel cytotoksisk virkning. Devitrificering, nemlig dannelse af iskerner eller iskrystaller under opvarmning af en forglasset opløsning eller ved et uheld under revision, transport eller opbevaring i damp, er en af de største risici ved vitrifikation58,59,60. For at forhindre afvitring og skade under opvarmningen skal temperaturforskellen mellem de første og sidste trin i processen derfor maksimeres. Som det fremgår af Seki og Mazur57 i murine oocytter underlagt vitrificering og opvarmning i forskellige hastigheder, jo hurtigere opvarmning, jo højere overlevelse. TS'ens volumen og temperatur er de vigtigste faktorer, der skal kontrolleres: TS skal opvarmes korrekt til 37 °C (mindst 1 time før proceduren), og det flydende nitrogenstativ skal fyldes til kanten af dets kapacitet og placeres så tæt som muligt på stereomikroskopet. Operatøren skal være så hurtig som muligt, mens kryopræserveringsbæreren overføres fra det flydende nitrogen til TS. På grund af den høje effektivitet af vitrificering kan en universel opvarmningsprotokol bruges uanset den involverede fryseprotokol, hvilket gør forvaltningen af alle opvarmningscyklusser lettere, selv når oocytter importeres fra et andet IVF-center61.

Åbne anordninger og risiko for kontaminering

Det er nødvendigt at anvende åbne systemer og direkte eksponering af prøverne for flydende nitrogen for at opnå de ekstremt høje køle- og opvarmningsrater, der understøtter effektiviteten af denne protokol. Selv om vitrificering er en procedure, der udgør en lav risiko for krydskontaminering, fordi den involverer meget små mængder og udføres efter flere prøvevask, der fortynder enhver formodet viral belastning, er det vigtigt at vedtage alle forebyggende foranstaltninger for at øge dens sikkerhed. På grundlag af de nuværende beviser udgør lukkede systemer ikke et konkurrencedygtigt alternativ til åbne systemer , i det mindste ikke til oocyt vitrifikation62,63. For at opretholde effektiviteten af åbne vitrifikationssystemer og samtidig minimere de risici, der er forbundet med direkte kontakt med flydende nitrogen, kan sidstnævnte steriliseres ved ultraviolet bestråling64,65. Alternativt kan dampopbevaringstanke anvendes, som er kendt for at udgøre en lavere risiko for forurening end konventionelle, men har vist sig at være effektive til at bevare oocyt levedygtighed66,67.

Betydningen af konstant overvågning af nøgleresultatindikatorer for oocyt vitrifikationsprogrammer

I et IVF-laboratorium er overvågning af KPI'er (Key Performance Indicators) afgørende for overvågning og konstant forbedring af resultaterne68. Når KPI'er defineres for overvågningsprocesser og -procedurer, bør der generelt overvejes tre hovedområder: struktur, proces og resultat. Strukturelle KPI'er måler kvaliteten af IVF-laboratoriet ved at skitsere de fysiske og menneskelige ressourcers karakteristika. Et eksempel på en strukturel KPI relateret til anlægget i et kryopræserveringsprogram kan være antallet af cryotanks i forhold til det samlede antal ART-procedurer, der kræver kryopræservering udført i en given periode eller antallet af kryotanke i forhold til de samlede kvadratmeter af kryorummet. Menneskelige ressourcer og især operatørkvalifikationer er imidlertid af største betydning, når det drejer sig om en vanskelig procedure som f.eks. Selv om vitrificeringsteknikken er yderst effektiv, er den faktisk en udfordrende procedure, der involverer flere procedurefaser med strenge tidsplaner, der skal kontrolleres strengt: En meget lille mængde af et betydeligt tyktflydende medium bør forvaltes over en meget kort periode.

Der er ikke involveret en frysemaskine med specifik indstilling af køleparametre i proceduren. Derfor er standardisering af protokoldetaljer og uddannelse af afgørende betydning. Den manuelle proces har strenge kvalifikationskrav, der skal opfyldes for at opnå ensartede og meget reproducerbare celleoverlevelsesrater. Hver nybegynderoperatør bør have særlig uddannelse for at gøre dem dygtige til at kontrollere alle de kritiske punkter i proceduren, navnlig prøvernes eksponeringstid for CPA'er og håndteringen af cellerne i et meget tyktflydende medium. Men ifølge Dessolle og coauthors,69 indlæringskurven for vitrification procedure bør ikke være så længe selv for junior embryologer som opnåelse af færdigheder er hovedsagelig begrænset af manipulation udfordringer. Når ekspertisen inden for vitrificering er opnået, skal den enkelte operatørs præstationer verificeres nøjagtigt og regelmæssigt ved hjælp af KPI'er til regelmæssigt at vurdere opretholdelsen af kompetenceværdier, der er fastlagt i konsensuspapir70. Desuden skal operatørens tillid/kompetence være sammenlignelig for ikke at påvirke resultaterne.

Proces-KPI'er måler, hvor godt IVF-laboratoriet fungerer. Vitrificerings- og opvarmningsprotokoller og -procedurer bør gennemføres rettidigt, og udsving i kulturforholdene bør minimeres ved at være særlig opmærksom på at opretholde tilstrækkelig osmolaritet og temperatur til bevarelse af ikke blot oocytudviklingskompetence, men også operatørens sikkerhed under håndtering af flydende nitrogen. Eksempler på proces-KPI'er er procentdelen af laboratoriepersonaleskader under håndtering af flydende nitrogen pr. antal IVF-procedurer om året, procentdelen af gameter/embryoner, der går tabt/beskadiges under vitrificerings-/opvarmningsprocedurer, og revisioner pr. antal procedurer pr. år.

Endelig måler KPI'erne for resultatet IVF-laboratoriets effektivitet og henviser generelt til overlevelse efter krigen defineret som andelen af morfologisk intakte oocytter på ICSI-tidspunktet (i tilfælde af oocyt vitrificering bør kompetenceværdien være >50 %, og benchmarkværdien er 75%)70. Derudover er satserne for befrugtning (< 10% lavere end de friske oocytter insemineret i centrum fra en sammenlignelig patientpopulation), embryoudvikling (det samme som en sammenlignelig patientpopulation ved hjælp af friske oocytter) og implantation (< 10-30% lavere end en sammenlignelig population af friske embryoner i centrum) gældende som resultat KPI'er for vitrificerede oocytter70. Kliniske resultater er dog mere underlagt parspecifikke egenskaber end defekte kliniske procedurer71,72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  2. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  3. Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
  4. Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
  5. Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
  6. Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
  7. Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
  8. Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
  9. Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
  10. Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
  11. Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
  12. Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
  13. Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
  14. Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
  15. Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
  16. Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
  17. Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
  18. Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
  19. Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
  20. Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
  21. Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
  22. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  23. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  24. Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
  25. ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
  26. Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
  27. Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
  28. Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
  29. Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
  30. Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
  31. Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
  32. Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
  33. Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
  34. Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
  35. Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
  36. Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
  37. Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
  38. Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
  39. Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
  40. Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
  41. Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
  42. Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
  43. Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
  44. Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
  45. Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
  46. Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
  47. Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
  48. Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
  49. Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
  50. Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
  51. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Biomedicine Online. 9 (6), 680-691 (2004).
  52. Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
  53. Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
  54. Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
  55. Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
  56. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  57. Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
  58. Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
  59. Jin, B., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biololgy of Reproduction. 82 (2), 444-450 (2010).
  60. Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
  61. Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
  62. Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
  63. Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
  64. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  65. Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
  66. Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
  67. Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
  68. Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
  69. Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
  70. Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
  71. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
  72. Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).

Tags

Biologi Problem 175 Fertilitetsbevarelse ovariestimulation metafase II oocyt vitrificering opvarmning nøgletal (KPI)
Fertilitetsbevarelse gennem Oocyte Vitrification: Kliniske og laboratorieperspektiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggiulli, R., Vaiarelli, A.,… More

Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter