Summary
Oocyte cryopreservation erkänns av flera internationella vetenskapliga samhällen som guldstandarden för fertilitetsbevarande hos postpubertala kvinnor. Lämpliga kliniska strategier och laboratoriestrategier säkerställer maximal effekt, effektivitet och säkerhet för fertilitetsbevarande behandlingar.
Abstract
Att bevara fertiliteten hos kvinnor är avgörande i ett multifunktionellt hälso- och sjukvårdssystem som tar hand om patienternas framtida livskvalitet. Oocyte cryopreservation erkänns av flera internationella vetenskapliga samhällen som guldstandarden för fertilitetsbevarande hos postpubertala kvinnor, för både medicinska och icke-medicinska indikationer. De viktigaste medicinska indikationerna är onkologiska sjukdomar, gynekologiska sjukdomar som svår endometrios, systemiska sjukdomar som äventyrar äggstocksreserven och genetiska tillstånd som involverar för tidig klimakteriet. Detta dokument beskriver hela kliniska och laboratorium arbete-up av en fertilitet bevarande behandling genom att beskriva rekommendationer för objektiva och evidensbaserade rådgivning. Dessutom är det inriktat på förfarandets effektivitet och beskriver de lämpligaste strategierna för att fullt ut utnyttja äggstocksreserven och maximera antalet äggceller som hämtas på kortast möjliga tid. Utvärderingen av äggstocksreserven, definitionen av ett idealiskt stimuleringsprotokoll, liksom oocyte hämtning, denudation och vitrification förfaranden har beskrivits tillsammans med metoder för att maximera deras effektivitet, effektivitet och säkerhet.
Introduction
Utvecklingen och genomförandet av ett effektivt kryopreservationsprogram för mänskliga äggceller har varit ett betydande genombrott inom reproduktiv medicin. Enligt nya bevis är vitrifiering den mest effektiva strategin för att cryopreserve metaphase II (MII) äggceller, eftersom det resulterar i statistiskt högre överlevnad jämfört med långsam frysning, oberoende av patientpopulationen (infertila patienter eller oocyte donationsprogram)1,2,3. De anmärkningsvärda prestationerna av oocyte vitrification ledde praxis kommittéer av American Society for Reproductive Medicine (ASRM) och Society for Assisted Reproductive Technology (SART) att uttala denna teknik för att vara den mest effektiva för elektektiv fertilitet bevarande hos postpubertala kvinnor, för både medicinska och icke-medicinskaindikationer 4,5,6. Medicinska indikationer för fertilitetsbevarande inkluderar (i) cancer och autoimmuna sjukdomar som kräverterapier 7 såsom strålbehandling, cytotoxisk kemoterapi och endokrin behandling (vars skadliga effekt på äggstocksreserven är förknippad med moderns ålder samt typ och dos av behandlingen); ii) Äggstockssjukdomar som kräver upprepad eller radikal kirurgi (t.ex. endometrios)8. och iii) genetiska tillstånd (t.ex. X-bräckliga) eller för tidigt äggstockssvikt. Dessutom har fertilitetsbevarande blivit ett värdefullt alternativ för alla kvinnor som inte har uppnått sitt föräldramål av icke-medicinska skäl (även känd som social frysning).
Oavsett indikationen för fertilitetsbevarande och enligt de stora internationella riktlinjerna för fertilitetsbevarande, bör alla patienter som är villiga att vitrify sina äggceller få lämplig rådgivning för att informeras om deras realistiska chans att lyckas, kostnaderna, riskerna och begränsningarna i förfarandet9,10,11,12,13. Viktigast av allt bör det vara tydligt att vitrifying en kohort av MII oocyter inte säkerställer en graviditet, men att det erbjuder en högre chans att lyckas för framtida in vitro-befruktning (IVF) behandling, om nödvändigt14. I detta avseende är kvinnans ålder vid tidpunkten för oocyte vitrification verkligen den viktigaste begränsande faktor15 som avancerad moderns ålder (AMA; >35 år) är den främsta orsaken till kvinnlig infertilitet16. Förutom en progressiv minskning av äggstocksreserven är AMA associerad med en försämring av oocytkompetens på grund av defekta fysiologiska vägar som metabolism, epigenetisk reglering, cellcykelkontroller och meiotisk segregering17. Därför beror det rimliga antalet ägg att vitrify främst på moderns ålder. Hos kvinnor yngre än 36 år krävs minst 8-10 MII-oocyter18 för att maximera chansen att lyckas. I allmänhet, ju högre antalet förrikade äggceller, desto högre är sannolikheten för framgång. Därför är skrädderi äggstocksstimulering enligt äggstocksreservmarkörer som anti-Müllerian hormon (AMH) nivåer eller antral follikel räknas (AFC) avgörande för att fullt ut utnyttja äggstocksreserven på kortast möjliga tid.
Säkerheten för hela förfarandet är den andra nyckelfrågan när man skriver in patienter för fertilitetsbevarande. Kliniker bör använda de bästa strategierna för att minimera riskerna och förhindra (i)ovariellt hyperstimuleringssyndrom (OHSS) genom att använda säkra metoder som gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) antagonistprotokoll följt av en GnRH-agonistutlösare19 och (ii) fjärrkontrollen, men ändå möjligt, risker för peritoneal blödning, skada på bäckenhålorna strukturer (ureter, tarm, tillägg, nerver) eller bäckenhålorna infektion under oocyte hämtning. Slutligen är (iii) traditionella stimuleringsregimer förknippade med suprafysiologisk serumestradiol och rekommenderas därför inte vid östrogenkänsliga sjukdomar som bröstcancer. Protokoll som omfattar aromatashämmare (t.ex. letrozol eller tamoxifen) är lämpligare i dessafall 20,21. I laboratoriemiljön är det mest utbredda protokollet för oocyte vitrification fortfarande det som först beskrivs av Kuwayama ochkollegorna 2,23, som består av ett stegvis förfarande som involverar gradvis tillsats av kryoprotekter (CPA). I den första fasen (jämvikt/uttorkning) exponeras oocyter i en CPA-lösning som innehåller 7,5% v/v etylenglykol och 7,5% v/v dimetylsulfoxid (DMSO), medan i den andra fasen, oocyter flyttas till en vitrifieringslösning med 15% v/v etylenglykol och 15% v/v DMSO, plus 0,5 mol/L sackaros. Efter en kort inkubation i vitrifieringsmediet kan äggcellerna placeras i särskilt utformade, öppna cryodevices och slutligen kastas i flytande kväve vid -196 °C för att lagras tills de används.
Här har hela det kliniska och laboratoriearbete som utförs av en fertilitetsbevarande behandling beskrivits av i) som beskriver rekommendationer för objektiv och evidensbaserad rådgivning, ii) med fokus på förfarandets kostnadseffektivitet och iii) beskriver de lämpligaste strategierna för att fullt ut utnyttja äggstocksreserven och maximera antalet äggceller som hämtas på kortast möjliga tid. Utvärderingen av äggstocksreserven, definitionen av ett idealiskt stimuleringsprotokoll, liksom oocyte hämtning, denudation och vitrification förfaranden kommer att specificeras tillsammans med metoder för att maximera deras effektivitet, effektivitet och säkerhet. Eftersom andra protokoll eller anpassningar av detta protokoll finns i litteraturen gäller de representativa resultaten och diskussionsavsnitten i detta manuskript endast för detta förfarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arbets- och klinisk rådgivning
OBS: Om patienter behöver fertilitetsbevarande av onkologiska skäl, se till att det inte finns någon väntelista för schemaläggningskonsultation, och mötet tillhandahålls så snart som möjligt.
- Undersök sjukdomshistoria och tidigare dokumentation samt bedöma patientens allmänna hälsostatus.
- Registrera all information (inklusive onkologens godkännande att genomgå äggstocksstimulering vid cancerpatienter) i en relationsdatabas.
- Ge patienten särskild rådgivning om förfarandets genomförbarhet. Förklara stegen i förfarandet (äggstocksstimulering, oocyte hämtning, oocyte vitrification) och informera henne om realistiska chanser att lyckas (främst beroende på moderns ålder och förväntat antal MII oocyter vid tidpunkten för oocyte hämtning), liksom kostnaden och begränsningarna i förfarandet.
- Utför transvaginal ultraljud för att få information om äggstocksreserven (dvs. AFC) och för att bedöma äggstockens tillgänglighet för äggsamling.
- Begär blodprov för att bedöma blodgrupp och Rhesusfaktor, koaguleringsscreening (blodräkning, protrombobin, tromboplastin, fibrinogen, protein C, protein S, anti-trombin III, homocystein) och infektionssjukdomar (hepatit B, hepatit C, HIV, Venereal Disease Research Laboratory/Treponema pallidum Hemagglutination Assay).
OBS: Om patienter får tillgång till ett fertilitetsbevarande program av icke-brådskande medicinska skäl, kan en mer omfattande bedömning omfatta basal follikelstimulerande hormon (FSH), luteinizing hormon (LH), estradiol, AMH, bröstundersökning, Papanicolaou test, genetisk screening av koagulering (faktor V av Leiden och prothrombin) och TORCH screening (toxoplasmos, röda hund, cytomegalovirus). - Begär en kardiologisk utvärdering (elektrokardiogram).
- Rekommendera psykologisk rådgivning.
2. Kontrollerade protokoll för äggstocksstimulering för fertilitetsbevarande
OBS: När den tid som är tillgänglig innan cancerbehandlingen påbörjas är begränsad rekommenderas protokollet för slumpmässig start (dvs. start av äggstocksstimulering när som helst under menstruationscykeln) för äggstocksstimulering hos onkologic patienter som är kandidater för fertilitetsbevarande. I ett fertilitetsbevarande program av icke-brådskande medicinska skäl eller sociala skäl är konventionell stimulering som börjar i den tidiga follikulära fasen att föredra, och äggstocksstimulering startas baserat på menstruationscykeln. Kontrollerade strategier för äggstocksstimulering (COS) bör utföras i enlighet med riktlinjerna för Europeiska samhället för mänsklig reproduktion och embryologi (ESHRE)nyligen 24.
- Skräddarsy COS enligt patientens egenskaper och äggstocksreservmarkörer, främst moderns ålder, FSH, AMH och AFC.
- Starta COS dag 5 av menstruationscykeln med rekombinant eller urinerad FSH med en fast dos på 150-300 IE/dag (antagonistprotokoll).
OBS: I en specifik patientpopulation med LH- brist eller dåligt suboptimalt svar kan ytterligare LH 75/150 IE/dag administreras enligt äggstockssvaret, LH- nivåerna och gynekologens bedömning. - Hos patienter med östrogenkänsliga sjukdomar, inkludera gonadotropiner associerade med aromatashämmare (letrozol) från dag 1 av stimulering till dag 7 efter oocyte hämtning.
- Administrera en fast dos gonadotropiner i 4 dagar.
- Övervaka follikulär tillväxt på dag 5 och sedan var 2-3 dagar; så småningom, justera gonadotropin dosering.
- När minst 3 folliklar når 17-18 mm i diameter, administrera avtryckaren för slutlig oocytemognad med en enda subkutan bolus av GnRH-agonist vid dosen 0, 5 ml.
3. Hämtning av oocyter
- Förberedelser för hämtning av oocyter
- För material som krävs, se materialförteckningenoch håll dig redo laboratorieskor och kläder, kirurgisk ansiktsmask, hårskydd, kirurgiska handskar, en permanent giftfri markör, pincett, sterila små gasbinda, engångs- eller återanvändbart spekulum, vaginal kirurgiutrustning och ytdesinfektionsmedel. Se till att det finns återupplivningsutrustning, bedövningsmedel för reversering, ett kit som är förberett för behandling av anafylaktisk chock och syre i operationssalen.
- Utför proceduren för hämtning av oocyter i enlighet med rekommendationerna från ESHRE:s arbetsgrupp för ultraljud i assisterad reproduktionsteknik (ART)25.
- Administrera sedering eller allmän anestesi och antibiotika mot profylax.
OBS: I detta protokoll uppnåddes djup sedering genom administrering propofol (vars dosering justeras enligt patientens vikt) och 50-100 μg fentanyl, 1000 mg paracetamol och assisterad maskventilation med syre. - Utför oocytehämtning med hjälp av en aspirationsenhet bestående av en vakuumpump, ett uppsamlingsrör som är anslutet till en 17 G enlumennål och ett oocytuppsamrande rör. Under insamlingen, överskrid inte ett tryck på ~ 120 mmHg för att undvika risken för skador på äggcellerna som att ta bort cumuluscellerna eller spräcka zona pellucida.
- Kalibrera arbetsytans temperatur för att säkerställa 37 °C i odlingsmediet. Under hela förfarandet, minimera oocyte exponering för även övergående temperatur som kan påverka deras utvecklingskompetens.
- Observera patienten i slutet av hämtningen av äggceller i 3-4 timmar före utskrivning.
- Administrera sedering eller allmän anestesi och antibiotika mot profylax.
- Operationsteater
- Innan du går in i operationssalen, identifiera patienten och bekräfta tidpunkten för ägglossningsutlösaren.
- Få patienten att ligga ner på operationsbordet i gynekologisk position.
- Rengör slidan/livmoderhalsen före hämtning av oocyt för att minimera bakteriell kontaminering.
- Utför en preliminär transvaginal ultraljud för att bedöma äggstockens position och de anatomiska relationerna med de olika organen och blodkärlen.
- Under ultraljudsvägledning, sätt in en enda lumennål genom vaginalväggen och i en äggstocks follikel, var försiktig så att du inte skadar organen eller blodkärlen som ligger mellan vaginalväggen och äggstocken.
- Börja ambition från närmaste follikel och gå vidare till de mest distala.
- Punktera alla folliklar med en diameter större än 11-12 mm och utför "vridningsrörelser" av nålen för att aspirera hela follikulärvätskan, som sedan släpps ut i ett sterilt rör (rund botten 14 ml) förvärmt i operationssalens blockvärmare.
- Omedelbart efter hämtning, försegla och märka röret med detaljer om patientens identitet.
- Se till att sjuksköterskan tar röret till laboratoriet, där det omedelbart screenas för förekomst av cumulus-oocytekomplex (COC).
- Instruera embryologerna att informera klinikern om det totala antalet COC som hämtats.
- När proceduren är klar för den första äggstocken, spola nålen med rent medium och fortsätt med den andra äggstocken med samma procedur.
- Efter oocyte hämtning, utvärdera eventuella blödningar från äggstockarna eller blodkärlen i parametrium och fri vätska i påsen douglas.
OBS: För att automatisera och förbättra effektiviteten av gamete och embryo spårbarhet på klinisk nivå, genomfördes ett elektroniskt vittnessystem (EWS) i mitten26. I detta protokoll nämns dock inte systemet för att säkerställa att protokollet återproduktivt i något IVF-laboratorium. Tänk dock på att alla steg i förfarandet kräver en andra operatör (dvs. ett vittne) för att säkerställa spårbarhet för vilt och embryon.
4. IVF-laboratorium
- Dagen före oocyte hämtningsproceduren
- Förbered äggceller (se materialförteckningen).
- Dispensera 1 ml IVF-medium (se materialförteckningen)i varje äggcellsuppsamlingsrör (rund botten, 5 ml) och täck med 0,2 ml mineralolja (se materialförteckningen)för embryokultur.
OBS: Antalet rör kommer att definieras beroende på antalet folliklar som förväntas hämtas. Varje rör kan innehålla upp till 4 COC.
- Dispensera 1 ml IVF-medium (se materialförteckningen)i varje äggcellsuppsamlingsrör (rund botten, 5 ml) och täck med 0,2 ml mineralolja (se materialförteckningen)för embryokultur.
- Försegla rören med locket (första snäppet). Märk rören med uppgifter om typ av medium och datum för beredning. Inkubera rören över natten vid 37 °C i kontrollerad atmosfär (6 % CO2,5 % 02).
- Förbered äggceller (se materialförteckningen).
- På dagen för hämtningen av oocyt
- Förvärm plasttillförseln vid 37 °C (sterila odlingsrätter och Pasteur-pipetter).
- Be patienterna bekräfta sin identitet (fullständigt namn och födelsedatum) och tidpunkten för ägglossningsutlösaren. Kommentera på laboratoriebladet att identifieringsproceduren (ID) har utförts och att tidpunkten för ägglossningsutlösaren har bekräftats.
- Ta bort äggcellsuppsamlingsrören från inkubatorn (precis innan proceduren börjar) och tryck ner locket för att säkerställa en tät stängning. Märk uppsamlingsrören för äggceller med patientens information. Placera äggcellsuppsamlingsrören i blockvärmaren vid 37 °C.
- Undersök follikulärvätskan i de förvärmde sterila odlingsfaten och identifiera COC: er. När en eller flera COC identifieras, skölj dem två gånger i två droppar medium för att avlägsna follikulär vätska och blodförorening.
- Överför COC:erna till äggcellsuppsamlingsrören och kommentera antalet COC på röret. Lossa locken på de medelstora rören och inkubera dem omedelbart vid 37 °C i en atmosfär av 6% CO2, 5% O2.
- Upprepa steg 7 till 9 beroende på antalet oocyter som hämtats. Uppdatera laboratoriebladet.
OBS: Se till att ett vittne kontrollerar att alla röruppvärmningsblock (inklusive de i operationssalen) är tomma och undertecknar att proceduren på laboratoriebladet stängs. - Torka av arbetsstadiet efter avslutad procedur.
5. Öocytförnekelse
- Förvärmning 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyra (HEPES)-buffrat medium och hyaluronidase (se materialförteckningen)vid 37 °C minst 1 timme före start.
- Förbered en 4-brunns IVF-platta (se materialtabellen)med 0,6 ml/brunn för förvärmt HEPES-buffrat medium (kompletterat med 5% humant serumalbumin [HSA]) täckt med 0,3 ml mineralolja för embryokultur och värm vid 37 °C i minst 30 min.
- Märk oocyte denudation plattan med detaljer om patientens identitet.
- Omedelbart innan proceduren påbörjas, tillsätt hyaluronidase till den första brunnen för att få en slutlig koncentration på ca 20 IE/ml.
- Placera ett begränsat antal COC (upp till 6) i den första brunnen som innehåller enzymet för att sprida cumuluscellerna.
- För att förbättra enzymatisk borttagning av cumulus- och koronacellerna, utför strippning av cumulusceller genom att pipettera äggcellerna upprepade gånger genom en Pasteur-pipett med en innerdiameter på cirka 250 μm i upp till 30 s. Efter inledande cell dissociation observeras, överför äggcellerna till den andra brunnen som innehåller endast HEPES-buffrat medium, var noga med att överföra en minsta mängd av enzymet.
- Utför ytterligare denudation för att ta bort coronacellerna genom att använda denuding pipetter med minskande inre diametrar (170-145 μm). Använd endast lägre diametrar (135 μm) om det är absolut nödvändigt.
- Tvätta försiktigt de denuded äggcellerna för att tvätta bort enzymet.
- Efter denudation, undersöka äggcellerna under ett inverterat mikroskop för att bedöma deras integritet och mognadsstadium. Separera MII-oocyter från de omogna (germinal vesikel och metafas-I).
- Flytta MII-äggcellerna till vitrifikationsområdet för att omedelbart utföra kryopreservation. Uppdatera laboratoriebladet.
6. Oocyte vitrification
OBS: Utför oocyte vitrification helst inom 38 h av oocyte hämtning och omedelbart efter denudation. Vitrifieringsproceduren som beskrivs här måste utföras vid rumstemperatur (RT) och genom att använda en stripppipett med en innerdiameter på 170 μm för att inte skada äggceller under manipulering.
- För ekvilibreringslösningen (ES) och vitrifieringslösningen (VS) till RT (25-27 °C) cirka 30 minuter före ingreppet.
- Korrekt märka cryodevices med patientens namn och ID, behandlings-ID, datum för frysning, antal äggceller och cryobarcode.
- Fyll ett engångskylningsställ upp till toppen med färskt flytande kväve och starta steriliseringsprocessen.
- Märk vitrifieringsplattan (se materialförteckningen)med patientens namn och ID. Be ett vittne kontrollera att cryodevices korrekta ID:t är korrekt.
- Vänd försiktigt varje injektionsflaska två gånger för att blanda innehållet före användning och förbered locket på en 6 mm Petri-skål med en droppe på 30 μL HEPES-buffrat medium (med 5% HSA) och en intilliggande droppe på 30 μL ES.
OBS: Placera droppar precis före användning för att begränsa medelhög avdunstning. - Använd en stripperpipett med diametern 170 μm och placera äggcellerna (upp till 9) i första droppen med minsta möjliga volym medium. Använd stripperpipetten och skapa en bro med medium mellan droppen n.1 och n.2 för att få en gradvis ökning av koncentrationen av CPA (figur 1A).
- Inkubera äggcellerna i första droppen i 3 minuter. Tillsätt en tredje droppe på 30 μL ES (n.3). Efter 3 min överför du äggcellerna till den andra droppen av ES och skapar en medelbro mellan dropparna n.3 och n.2 (Figur 1B). Inkubera äggcellerna i droppe n.3 i 3 min.
- Under inkubationen, tillsätt en 30 μL droppe ES för varje kryodevice som kommer att användas (om 9 äggceller ska kryopreserveras, placera 3 droppar ES med 3 äggceller i varje droppe ES). Flytta äggcellerna till ren ES-lösning och låt dem vara i 6-9 minuter (tills de återfår sin ursprungliga storlek efter krympning) (Figur 1C).
- Förbered en central brunnsform (60 x 15 mm) med 1 ml VS. I slutet av de första 6 min, överför äggcellerna för att kryopreserveras till VS-lösningen och släpp så lite medium som möjligt. Lämna äggcellerna i VS i 1 min och tvätta dem försiktigt genom att flytta dem från botten till toppen av skålen för att ta bort överskottet av ES.
- Ungefär 10 s före slutet av inkubationsminuten, placera kryodevicen under mikroskopet och justera fokus på det svarta märket (dvs. spetsen på kryodevicen). Placera äggcellerna på kryodevicen bredvid det svarta märket med minsta möjliga mängd VS (figur 2A).
- Flytta stripppipetten bort från äggcellerna och ta bort överskottet av VS-medium (figur 2B) så att äggcellerna förblir täckta av ett tunt skikt av medium (figur 2C).
- Doppa snabbt kryodevicen i flytande kväve och skaka den snabbt för att ta bort luftbubblor från ytan. Håll kryodevicens skyddslock med pincett och fyll det med flytande kväve; sätt sedan in kryodevicen i den samtidigt som propylenremsorna finns i flytande kväve.
- Förvara kryodevicen i en visiotube som tidigare märkts med patientens information. Uppdatera laboratoriebladet.
7. Oocyt uppvärmning
- Värm upptiningslösningen (TS), utspädningslösningen (DS) och tvättlösningen (WS) till RT (25-27 °C) cirka 30 minuter före ingreppet. Vänd försiktigt in varje injektionsflaska två gånger för att blanda innehållet. Placera 1 ml TS i en central petriskål och värm den vid 37 °C i minst 1 timme innan du påbörjar proceduren.
- Märk alla plasttillbehör med patientens namn och ID samt typ av lösning. Be ett vittne bekräfta patientens uppgifter om kryodevicen.
- För varje cryodevice som ska värmas, förbered en 6-brunnsplatta med 200 μL DS i den första brunnen och lika mycket WS i den andra respektive tredje (med namnet WS1 respektive WS2). Tillsätt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller sterilt vatten i området utanför brunnarna för att förhindra avdunstning.
- Ta ut TS-skålen ur inkubatorn och placera den under mikroskopet. Justera mikroskopets fokus till mitten av Petri-skålen.
- Vrid försiktigt och ta bort kryodevicens skyddslock, samtidigt som propylenremsorna finns i flytande kväve. Överför cryodevice från flytande kväve till TS så snabbt som möjligt för att undvika risken för avvitrifiering och initiera nedräkningen (1 min).
- Lokalisera äggcellerna genom att fokusera på spetsen av kryodevicen (dvs. det svarta märket). Använd en stripppipett och släpp ut äggcellerna från kryodevicen.
OBS: Försök att inte aspirera äggcellerna från kryodevicen; släpp försiktigt några media på dem tills de flyttar in i TS. - Använd en stripperpipett med diametern 170 μm, överför äggcellerna till DS med en liten mängd TS (för att skapa en gradient) och lämna dem i DS i 3 minuter. Flytta äggcellerna till WS1 också och lämna dem i 5 minuter. Slutligen överför äggcellerna till WS2 i 1 minut.
- Överför äggcellerna till ett lämpligt preequilibrerat IVF-odlingsmedium och inkubera dem i 1 timme innan du fortsätter med intracytoplasmisk spermieinjektion (ICSI). Uppdatera laboratoriebladet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Översikt över fertilitetsbevarande programmet i centrum
Under en 12-årsperiod (2008-2020) genomgick 285 kvinnor minst en oocyte retrieval som innebär vitrifiering av hela kohorten av mogna ägg som samlats in. De flesta av dessa kvinnor (n=250) genomgick en enda hämtning och 35 genomgick flera retrievals. Orsakerna till att genomgå oocyte hämtning för ägg vitrification sammanfattas i 4 kategorier: medicinsk (med undantag för cancer), cancer, icke-medicinsk, och andra. Bland de 250 kvinnor som genomgår en enda oocyte hämtning för ägg vitrification, 8% hade medicinska skäl annat än cancer (10 endometrios, 3 myom, 4 äggstockscystor, 1 hydrosalpinx), 16% hade cancer (31 bröstcancer, 3 äggstockscancer, 2 kolorektal cancer, 2 Hodgkins lymfom, 1 vulvar cancer e 1 livmoderhalscancer), 53% hade icke-medicinska skäl och 23% hade andra orsaker (43 frånvaro av spermier hämtas, 10 risk för OHSS, 4 infektioner och 1 feber). Denna fördelning var olika bland patienter som genomgår flera oocyte retrievals för ägg vitrification. Specifikt hade 9% andra medicinska skäl än cancer (1 endometrios, 2 minskad äggstocksreserv), 6% hade cancer (2 bröstcancer), 80% hade icke-medicinska skäl och 3% hade andra skäl (1 frånvaro av spermier hämtade). Ingen av de patienter som genomgår flera äggocyte retrievals för ägg vitrification värmde dessa ägg, medan 78 av de 250 kvinnor som genomgår en enda ägg vitrification cykel återvände för att använda dessa äggceller (Figur 3).
Tabell 1 sammanfattar data för de 250 kvinnor som genomgår en enda oocyte vitrification cykel grupperas enligt relaterade skäl. Patienterna med medicinsk anledning till äggvitrifiering och patienter som genomgår fertilitet bevarande på grund av cancer var yngre (genomsnittlig moderns ålder < 35 år) och visade en bättre äggstocksreserv (högre AFCs) än patienter med icke-medicinska eller andra skäl. Den genomsnittliga mognadsgraden (antalet MII-oocyter/antal coc-datorer som hämtades) var dock något lägre (72-73% jämfört med 77-79%), så att antalet oocyter som vitrifierades i genomsnitt var liknande i de 4 grupperna (9-10 äggceller). Viktigt, 9 av 40 oncologic patienter (22,5%) genomgick en slumpmässig start äggstockscancer stimulering protokoll eftersom de hade begränsad tid innan påbörjad kemoterapi- eller strålbehandling. Det är intressant att ungefär hälften av patienterna med andra medicinska skäl än cancer (53%) och majoriteten av patienterna med andra orsaker till äggvitrifiering (76%) faktiskt återvände för uppvärmning. Omvänt använde mycket få patienter som genomgick fertilitetsbevarande för cancer (17, 5%) eller icke-medicinska skäl (13%) sina förförligade äggceller för IVF. Också anmärkningsvärt är den tid som förfluter mellan vitrifiering och uppvärmning bland de patienter som återvände: i genomsnitt 283 dagar hos patienter med andra medicinska skäl än cancer, 132 dagar hos patienter med andra skäl, 1264 dagar hos oncologic patienter och 1547 dagar hos patienter med icke-medicinska skäl. Oavsett alla dessa relevanta skillnader var överlevnadsgraden likartad (83-88%; i genomsnitt värmdes 8-11 äggceller och 7-9 äggceller överlevde) mellan patienterna i de 4 grupperna, vilket bekräftar effektiviteten och säkerheten hos oocyte vitrification och värmande protokoll. Dessutom är överlevnadsgraden oberoende av vitrifiering och uppvärmningsoperatörens erfarenhet (figur 4A,B). Tabell 1 visar befruktningsgraden i de 4 grupperna, som är ~70%, med undantag för patienter med icke-medicinska skäl för oocytevitrifiering (~80%). Dessa data är dock inte jämförbara på grund av en liten provstorlek och spermiefaktorns partiskhet på befruktningsresultatet27.
Bild 1:Medium droppe konfiguration för oocyte cryopreservation. För att gradvis utföra jämvikt placeras oocyter först ien ( A) droppe BS och blandas med (B) en droppe ES. Efter 3 min inkubation, (C) blandas en tredje droppe ES-lösningoch äggceller inkuberas i 6-9 min. Förkortningar: HEPES = 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyra; BS = HEPES-buffrat medium; ES = jämviktslösning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Oocytbelastning på kryopreservationsenhet. Äggcellerna placeras på kryodevicen i (A) en enda liten droppe VS. (B)Stripppipetten flyttas bort frånäggcellerna, och ( C )överskottetav VS omsugs för att lämna bara ett tunt lager runt varje äggcell. Förkortning: VS = vitrification lösning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Oocyte vitrification cykler utförs vid GENERA centrum för reproduktiv medicin i Rom (år 2008-2020). Under 12-årsperiod genomgick 250 patienter en enda oocyte hämtning för oocyte vitrification, medan 35 genomgick flera oocyte hämtning cykler. De inneboende orsakerna till oocyte vitrification visas i figuren. De patienter som återvänder för uppvärmning (n=78) tillhör endast den grupp kvinnor som genomgick en enda oocyte vitrification cykel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Genomsnittlig överlevnad per kohort av uppvärmda äggceller. A)Vitrifiering och ( B )uppvärmningav operatörernas erfarenhet. Varje patient ingår endast för den första uppvärmningscykeln. Statistiskt signifikanta skillnader bedömdes med Mann-Whitney U-test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Oocytmorfologi i början och slutet av jämviktsförfarandet. För att bestämma resultatet av jämviktsförfarandet kan det vara användbart att kommentera (A) oocytmorfologi innan proceduren påbörjas. B)En kraftig krympning av äggcellen observeras efter första exponeringen för kryoprotektantlösningen. Jämviktsförfarandet kan anses vara fullständigt när( C) äggcellen har återfått sin ursprungliga volym. Skalstänger = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Orsak till oocyte vitrification | Annan medicinsk än cancer (n=19) | Cancer (n=40) | Icke-medicinsk (n=133) | Övrigt (n=58) |
| Moderns ålder vid hämtning av oocyter, medelvärde±SD | 33,6±6,4 år | 34,6±5,9 år | 37.0±3.4 år | 38,2±4,3 år |
| Basal FSH, medelvärde±SD | 7.5±4.2 IE/L | 7.6±1.7 IE/L | 7.8±4.1 IE/L | 8.8±5.2 IE/L |
| AMH, medelvärde±SD | 1.8±1.7 ng/ml | 1.9±0.2 ng/mL | 2.2±2.4 ng/mL | 3.0±2.5 ng/mL |
| AFC, medelvärde±SD | 12.7±5.0 | 13.3±7.0 | 11.6±6.1 | 10.7±6.7 |
| BMI, medelvärde±SD | 20.1±1.5 | 21.8±1.6 | 20.2±3.1 | 22.9±3.6 |
| Stimuleringens längd, medelvärde±SD | 10.0±1.5 | 9.6±1.7 | 9.9±2.1 | 10.3±2.1 |
| 9/40, 22.5% | ||||
| Slumpmässig start | ||||
| COC, totalt, medelvärde±SD | 239 | 551 | 1493 | 592 |
| 12.6±5.3 | 13.8±9.1 | 11.2±7.1 | 10.2±8.5 | |
| MII-oocyter, totalt, medelvärde±SD | 167 | 400 | 1161 | 462 |
| 8.8±3.3 | 10.0±7.2 | 8.7±5.7 | 8.0±6.7 | |
| Mognadsgrad, medelvärde±SD | 72,4±13,6% | 72,1±19,6% | 79,5±17,5% | 77,4±22,2% |
| Patienter som återvänder för uppvärmning, totalt % av patienterna som genomgick vitrifikation | 10/19, 52.6% | 7/40, 17.5% | 17/133, 12.8% | 44/58, 75.9% |
| Dagar mellan vitrifiering och första uppvärmning, medelvärde±SD | 283±225 | 1264±764 | 1547±709 | 132±203 |
| Uppvärmda MII-oocyter, totalt medelvärde±SD | 82 | 66 | 191 | 409 |
| 8.2±2.8 | 9.4±4.8 | 11.2±5.8 | 9.3±7.2 | |
| Överlevde MII-oocyter, totalt medelvärde±SD | 73 | 55 | 160 | 345 |
| 7.3±3.3 | 7.9±4.0 | 9.4±4.8 | 7.8±6.9 | |
| Överlevnadsgrad, medelvärde±SD | 87,6±18,1% | 83,2±1,7% | 85,4 % ±14,5 % | 84,7 ±21,9% |
| Spermiefaktor | ||||
| N, n, % | 5/10, 50% | 4/7, 57% | 13/17, 76% | 13/44, 29% |
| Penningmarknadsfonden, n, % | 3/10, 30% | 3/7, 43% | 3/17, 18% | 17/44, 39% |
| OAT, n, % | 2/10, 20% | - | 1/17, 6% | 11/44, 25% |
| NOA, n, % | - | - | - | 3/44, 7% |
| Befruktningsgrad, medelvärde±SD | 70,0±14,4% | 70,0±17,0% | 78,5±20,6% | 71,0±24,3% |
Tabell 1: Patienter som genomgår en enda cykel av oocyte vitrification. Förkortningar: FSH = follikelstimulerande hormon; AMH = anti-Müllerian hormon; BMI = kroppsmasseindex; COC = cumulus oocyte komplex; MII = metafas II; N = normozoospermic; MMF = måttlig manlig faktor (1-2 spermiedefekter); OAT = oligoasthenoteratozoospermic; NOA = icke-obstruktiv azoospermi (spermier samlades in genom testikel spermier extraktion).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kliniska överväganden
Även om framväxande strategier, såsom äggstocksvävnad cryopreservation och in vitro mognad, har utforskats, oocyte vitrification efter COS är guld standard teknik för fertilitet bevarande. I detta scenario bör antalet äggceller som hämtas och kryopreserveras maximeras på kortast möjliga tid eftersom de flesta cancerpatienter kan dra enbart nytta av en äggstockscykel innan de måste påbörja sin cancerbehandling. Således är ett korrekt äggstocksstimuleringsprotokoll avgörande för att fullt ut utnyttja äggstocksreserven och öka den kumulativa chansen för en framtida levandefödelse 28, ett resultat som är starkt beroende av moderns ålder vid oocyte hämtning. I detta avseende har en idealisk ålder för oocytevitrifiering för fertilitetsbevarande ändamål ännuinte föreslagits 29, och en konsensus krävs mellan antingen 35år 18 eller 37 år30,31. Fertilitetsbevarande bör dock vara tillgängligt för alla patienter, inklusive kvinnor över 37 år, förutsatt att de får lämplig rådgivning om framgångsgraden baserat på deras ålder.
Protokollet och startdosen av mediciner bör beskrivas enligt gynekologens bedömning och viktigast av allt, baserat på den tillgängligatiden 32,33. Start av konventionell stimulering i den tidiga follikulära fasen rekommenderas när tiden inte är ett problem. Vid behov är dock slumpmetoden möjlig för att minimera förseningar i början av brådskande cancer / medicinska behandlingar34,35. Follicular utveckling har rapporterats vara en extremt dynamisk process som flera vågor av follikel rekrytering har beskrivits under en enda äggstockscancer cykel. Även om de biologiska mekanismerna bakom detta fenomen fortfarande måste avtäckas, kan kompetenta oocyter hämtas och kryopreserveras oberoende av fasen av menstruationscykeln där COS startas36.
I detta centrum utförs äggstocksstimulering vanligtvis med GnRH-antagonistprotokollet och 150-300 IE/dag av rekombinant-FSH eller humant klimakteriet gonadotropin. I specifika populationer av patienter äldre än 35 år, med LH- brist, eller visar suboptimalt svar efter standard COS, kan LH tillsättas under COS för att öka rekryteringen och tillväxten av folliklar genom en synergisk verkan med insulinliknande tillväxtfaktor 116,37,38. Dessutom har GnRH-antagonistprotokollet följt av en GnRH-agonistutlösare rapporterats vara ett kort, säkert och mycket bekvämt stimuleringsprotokoll för att maximera äggstockssvaret och minimera risken för OHSS39. Hos patienter med östrogenkänsliga sjukdomar som bröstcancer administreras gonadotropiner associerade med aromatashämmare, såsom letrozol,20.
I själva verket visade en ny granskning att letrozol innebär liknande äggstockssvar som konventionell stimulering utan komplikationer när det gäller medfödda defekter, malignitet återkommande och ökaddödlighet 40. På samma sätt kan tamoxifen användas under COS vid östrogenkänsliga tumörer, som, liksom letrozol, visade ingen inverkan på oocytkompetens41,42. Detta måste dock bekräftas i större studier. I detta centrum administreras letrozol från dag 1 av stimulering upp till dag 7 efter oocyte hämtning vid estradiol känsliga tumörer. Risken för OHSS, som är den viktigaste komplikationen av COS som också ytterligare skulle försena cancerbehandlingar, bör övervägas, särskilt hos unga patienter med höga afcs. I dessa fall har utlösa ägglossning med en GnRH agonist istället för mänskliga chorionic gonadotropin (hCG) visat sig vara fördelaktigt. Andra frågor som måste förebyggas är (i) trombo-emboli, vilket kräver administrering av lågmolekylär vikt heparin under COS, och ii) ett reducerat äggstockssvar efter COS43. För att kompensera för den senare kan två på varandra följande stimuleringar i en enda äggstockscykel utföras. Detta nya okonventionella COS-protokoll, känt som DuoStim, innebär follikulära och luteala fasstimuleringar och två oocyte retrievals på kort tid (~ 15 dagar) och bör undersökas för fertilitetsbevarande ändamål iframtiden 44,45,46.
Andra möjliga strategier för fertilitetsbevarande hos kvinnor är: (i) äggstocksvävnads cryopreservation, vilket är det enda tillgängliga alternativet för prepubertala honor. Denna möjlighet är lovande för att återställa reproduktiv och endokrina verksamhet och undvika dröjsmål med att starta cancerbehandling eftersom ingen hormonell stimulering behövs. Det är dock fortfarande experimentellt och kräver laparoskopisk kirurgi med senare transplantation, och det finns risk för ortopisk cancer retransmission. ii) Embryo cryopreservation, som innebär en högre överlevnad efter uppvärmningen, men fördröjer cancerbehandlingen och kräver att en manlig partner eller donator involveras, vilket också begränsar en kvinnas framtida reproduktiva autonomi47. Dessutom kan det bli föremål för rättsliga begränsningar i vissa länder. Med tanke på dessa begränsningar anses oocyte vitrification vara det mest etablerade och etiskt acceptabla tillvägagångssättet. Helst bör alla större sjukhus, där kvinnor som drabbas av cancer i sin reproduktiva ålder behandlas, tillhandahålla program för fertilitetsbevarande, och hela processen bör vara gratis för dessa patienter för att säkerställa lika tillgång till detta program. Ändå måste oocyte cryopreservation utföras enbart i centra med tillräcklig expertis för att inte påverka oocytekompetens i processen48.
Kritiska steg i vitrifieringsprotokollet och felsökning
Vitrification är en pseudo andra ordningens fasövergång (IUPAC Compendium of Chemical Terminology) som inducerar en glasliknande stelning inuti cellerna som förhindrar iskristallkärna och tillväxt, den viktigaste orsaksfaktorn för cellskada. För att uppnå korrekt vitrifiering krävs en kombination av minst två CPA (vanligtvis etylenglykol och DMSO som genomsläppande medel och sackaros som icke-genomsläppande medel) tillsammans med en extremt hög kylhastighet (>20 000 °C/min) som uppnås antingen genom att minimera belastningsvolymerna eller genom direkt exponering av proverna för flytande kväve (öppna anordningar). Eftersom äggceller är kroppens största celler innehåller de den största mängden vatten. Därför är de känsligare för frysskador än embryon. Under oocyt kryopreservation, skador på intracellulära organeller (t.ex. cytoskeleton eller meiotisk spindel), förändring av membranpermeabilitet, zona pellucida härdning, oocyte aktivering, förändring av biokemiska vägar, och eventuellt celldöd kanuppstå 49. Av denna anledning måste en delikat balans mellan flera faktorer säkerställas för ett framgångsrikt bevarande av oocyt livskraft och utvecklingskompetens. För att uppnå konsekvens i överlevnadsgraden efter vitrifiering och nå referensnivåerna måste alla avgörande steg i förfarandet kontrolleras strikt.
CPA, cellosmolalitet och kylhastigheter
För att öka sannolikheten för vitrifiering måste mediets viskositet (och därmed CPA-koncentrationen) maximeras. CpA:ornas toxicitet bör dock alltid hållas under kontroll50. För detta ändamål är det viktigt att minimera både tidpunkten för cellexponering för CPA och belastningsvolymerna och alltid arbeta vid rumstemperatur (25-27 °C)51. Andra protokoll omfattar olika kombinationer av cpa och kryodevices och utförs vid 37 °C. De har dock inte beskrivits här. Således gäller anteckningarna, representativa resultat och diskussionsavsnitten i detta manuskript endast för vitrificationprotokollet som beskrivs här.
Under kryopreservation utsätts äggcellerna för CPA-lösningar med ökad osmolytkoncentration för att främja celluttorkning och cytoplasmisk krympning. Under uppvärmningen utsätts de för lösningar med minskad osmolytkoncentration för att återställa den cytoplasmiska volymen. Under vitrifieringen är äggcellerna uttorkade, och oavsiktliga fluktuationer i cellvolymen kan orsaka allvarliga osmotiska chocker, vilket äventyrar överlevnad och utvecklingspotential efter uppvärmning52. Att hitta den optimala kylhastigheten är en viktig aspekt för att bevara cellens livskraft eftersom det påverkar osmolaliteten53 och cellutvecklingspotentialen54. Till exempel, när en cell utsätts för kylhastigheter långsammare än de optimala hastigheterna, kan den i stor utsträckning utsättas för hypertona tillstånd som leder till celldöd.
För att uppnå optimal kylhastighet bör belastningsvolymerna minimeras, RT bör kontrolleras så att jämviktsprocessen inte påverkas, och proverna bör direkt utsättas för flytande kväve. Ett sätt att bedöma när jämvikt har uppnåtts är att kommentera oocytens morfologi (i synnerhet bredden på det perivitelliniska utrymmet och tjockleken på zona pellucida) före förfarandets början (figur 5A). Efter en inledande fas av cellvolymminskningen(figur 5B)förväntas äggcellen återställa sin ursprungliga volym (figur 5C). Även om korrekt pH upprätthålls under oocytehantering under luftatmosfär på grund av zwitterions buffring av vitrification-värmande lösningar, är medium osmolalitet istället särskilt beroende av temperatur53. Därför är metoden för diskberedning avgörande för att minska eventuell skadlig effekt55.
Oljeöverlägg är verkligen avgörande för att förhindra avdunstning och undvika någon ökning av osmolaliteten i IVF-media56. Det kan dock inte användas när vitrifierings- och uppvärmningsförfarandena utförs. Därför är vissa tips viktiga för operatörer: (i) förbereda dropparna så snabbt som möjligt och omedelbart före användning; ii) överväga större volymer droppar för att minimera förändringar i osmolaritet (<30 μL rekommenderas inte), iii) När miljöförhållandena inte kan standardiseras kan en 6-brunnsplatta användas, och sterilt vatten eller PBS kan tillsättas den intilliggande behållaren för att begränsa avdunstningen. iv) var uppmärksam på datumet för den första öppnandet av injektionsflaskan av medium eftersom osmolaliteten kan ändras om flaskan öppnas upprepade gånger.
Oocyt uppvärmning och oocyte devitrification
Det viktigaste steget som kan påverka konsekvensen i överlevnadsgraden är definitivt uppvärmningsprocessen57. Under detta steg avlägsnas CPA gradvis från äggcellen och späds ut för att förhindra eventuell cytotoxisk effekt. Avvitrifiering, nämligen bildandet av iskärnor eller iskristaller under uppvärmningen av en förglasad lösning eller oavsiktligt under revision, transport eller lagring i ånga, är en av de största riskerna med vitrifikation58,59,60. För att förhindra avvitrifiering och skada under uppvärmningen måste därför temperaturskillnaden mellan de första och sista stegen i processen maximeras. Som visas av Seki och Mazur57 i murinoocyter som utsätts för vitrifiering och uppvärmning i olika takt, desto snabbare uppvärmning, desto högre överlevnad. TS volym och temperatur är de viktigaste faktorerna att kontrollera: TS bör värmas ordentligt till 37 °C (minst 1 timme före proceduren), och det flytande kvävestället ska fyllas till kanten av sin kapacitet och placeras så nära stereomikroskopet som möjligt. Operatören bör vara så snabb som möjligt när kryopreservationsbäraren överförs från det flytande kvävet till TS. På grund av vitrifieringens höga effektivitet kan ett universellt uppvärmningsprotokoll användas oavsett frysprotokollet, vilket gör hanteringen av alla uppvärmningscykler enklare även när äggceller importeras från ett annat IVF-center61.
Öppna anordningar och risk för kontaminering
Det krävs att man använder öppna system och direkt exponering av proverna för flytande kväve för att uppnå de extremt höga kylnings- och uppvärmningshastigheter som stöder protokollets effektivitet. Även om vitrifiering är ett förfarande som utgör låg risk för korskontaminering, eftersom det innebär mycket små volymer och utförs efter flera provtvättar som späder ut någon förmodade virusbelastning, är det viktigt att anta alla försiktighetsåtgärder för att öka dess säkerhet. På grundval av aktuella bevis erbjuder slutna system inte ett konkurrenskraftigt alternativ till öppna system åtminstone för oocytevitrifiering62,63. För att bibehålla effektiviteten hos öppna vitrifieringssystem samtidigt som riskerna med direkt kontakt med flytande kväve minimeras, kan den senare steriliseras genom ultraviolett bestrålning64,65. Alternativt kan ånglagringstankar användas, som är kända för att utgöra en lägre risk för förorening än konventionella, men har visat sig vara effektiva för att bevara oocyt livskraft66,67.
Vikten av ständig övervakning av nyckeltal för oocytevitrifieringsprogram
I ett IVF-laboratorium är övervakning av nyckeltal (KPI: er) avgörande för övervakning och ständigt förbättra resultaten68. När ki-politiska beffleringsgrupper definieras för övervakningsprocesser och övervakningsförfaranden bör man i allmänhet överväga tre huvudområden: struktur, process och resultat. Strukturella KPI:er mäter IVF-laboratoriets kvalitet genom att beskriva egenskaperna hos fysiska och mänskliga resurser. Ett exempel på en strukturell KPI relaterad till anläggningen i ett kryopreservationsprogram kan vara antalet kryotankar i förhållande till det totala antalet ART-procedurer som kräver kryopreservation som utförs under en viss tidsperiod eller antalet kryotankar i förhållande till kryoroomets totala kvadratmeter. Mänskliga resurser och i synnerhet operatörskompetens är dock av yttersta vikt när det gäller att hantera ett känsligt förfarande som vitrifiering. Även om vitrifieringstekniken är extremt effektiv är den ett utmanande förfarande som omfattar flera procedurfaser med stränga tidpunkter som måste kontrolleras strikt: en mycket liten mängd av ett betydligt trögflytande medium bör hanteras under en mycket kort period.
Ingen frysmaskin med specifik inställning av kylparametrar deltar i förfarandet. Därför är standardisering av protokolldetaljer och utbildning avgörande. Den manuella processen har strikta färdighetskrav som måste uppfyllas för att uppnå konsekventa och mycket reproducerbara cellöverlevnadsgrader. Särskild utbildning bör tillhandahållas varje nybörjare för att göra dem skickliga på att kontrollera alla kritiska punkter i förfarandet, särskilt provernas exponeringstid för CPA och hanteringen av cellerna i ett mycket trögflytande medium. Men enligt Dessolle och medförfattarebör 69 inlärningskurvan för vitrifieringsförfarandet inte vara så lång även för yngre embryologer eftersom uppnåendet av färdigheter huvudsakligen begränsas av manipulationsutmaningar. När sakkunskap om vitrifiering har uppnåtts måste varje enskild operatörs resultat kontrolleras noggrant och regelbundet med hjälp av KPI:er för att regelbundet bedöma upprätthållandet av kompetensvärden som fastställs i konsensusdokument70. Dessutom måste operatörens förtroende/kompetens vara jämförbar för att inte påverka resultaten.
Process-KPI:er mäter hur bra IVF-laboratoriet fungerar. Vitrifierings- och uppvärmningsprotokoll och förfaranden bör genomföras i tid, och fluktuationer i odlingsförhållandena bör minimeras genom särskild uppmärksamhet för att upprätthålla tillräcklig osmolaritet och temperatur för bevarandet av inte bara oocyteutvecklingskompetens utan också av operatörens säkerhet vid hantering av flytande kväve. Exempel på process-KPI:er är andelen laboratoriepersonalskador vid hantering av flytande kväve per antal IVF-procedurer per år, andelen gameter/embryon som förlorats/skadats under vitrifierings-/uppvärmningsförfaranden och revisioner per antal procedurer per år.
Slutligen mäter KPI:er resultatet effektiviteten hos IVF-laboratoriet och hänvisar i allmänhet till eftervärmande oocytöverlevnad definierad som andelen morfologiskt intakta oocyter vid tidpunkten för ICSI (vid oocytevitrifiering bör kompetensvärdet vara >50% och referensvärdet är 75%)70%. Dessutom är befruktningstakten (<10% lägre än de färska äggceller som inseminerats i mitten från en jämförbar patientpopulation), embryoutveckling (samma som en jämförbar patientpopulation med färska oocyter) och implantation (<10-30% lägre än en jämförbar population av färska embryon i mitten) tillämpliga som resultat KPI för vitrifierade oocyter70. Kliniska resultat är dock mer föremål för parspecifika egenskaper än felaktiga kliniska förfaranden71,72.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection | |||
| Equipment | |||
| Hot plate | IVF TECH | ||
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermometer | |||
| Test tube Warmer | |||
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Vacuum Pump | Cook | K-MAR-5200 | |
| Consumables | |||
| CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| Ovum Aspiration Needle (Single lumen) | Cook | K-OSN-1730-B-60 | |
| Primaria Dish | Corning | 353803 | Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish |
| Round- bottom tubes | Falcon | 352001 | Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap |
| Round- bottom tubes | Falcon | 352003 | Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap |
| Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | |
| Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE |
| Denudation | |||
| Equipment | |||
| CO2 incubator | Eppendorf | Galaxy 14S | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl |
| Human Serum Albumin | thermoFisher Scietific | 9988 | |
| Hyaluronidase | Fujifilm Irvine Scientific | 90101 | 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF |
| IVF culture dish (60 x 15mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
| Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | 1 mL for pasteur pipettes |
| Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE |
| stripping pipette tips (140 µm) | Cook | K-FPIP-1140-10BS-6 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| stripping pipette tips (130 µm ) | Cook | K-FPIP-1130-10BS-7 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification | |||
| Equipment | |||
| Electronic Timer | |||
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
| Human Serum Albumin | Fujifilm Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
| Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
| stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification Freeze kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90133-so | 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL) |
| Vitrifit | Coopersurgical Origio | 42782001A | VitriFit Box |
| Warming | |||
| Equipment | |||
| Electronic Timer | |||
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
| k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
| CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
| IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| SAtripping pipette tips (300µm) | Cook | K-FPIP-1300-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification Thaw kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90137-so | 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL) |
References
- Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
- Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
- Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
- Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
- Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
- Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
- Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
- Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
- Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
- Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
- Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
- Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
- Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
- Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
- Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
- Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
- Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
- Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
- Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
- ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
- Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
- Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
- Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
- Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
- Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
- Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
- Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
- Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
- Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
- Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
- Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
- Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
- Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
- Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
- Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
- Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
- Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
- Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
- Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
- Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
- Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
- Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
- Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
- Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
- Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
- Fuller, B., Paynter, S.
- Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
- Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
- Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
- Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
- Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
- Jin, B., et al.
- Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
- Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
- Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
- Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
- Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
- Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
- Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
- Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
- Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
- Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
- Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).
