एक शुद्ध DEC-205-विट्रो में माउस Dendritic कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए पूर्ण लंबाई प्रोटीन के साथ एंटीबॉडी निर्देशित और वीवो में रासायनिक Conjugation
Summary
हम वीवो डेंड्रिटिक सेल टार्गेटिंग में एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए मॉडल एंटीजन ओवलबुमिन के रासायनिक संयुग्मण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल में एंटीबॉडी का शुद्धिकरण, एंटीजन का रासायनिक संाधीनता, साथ ही संजूगेट का शुद्धिकरण और कुशल संाधीनता का सत्यापन शामिल है।
Abstract
वीवो में डेंड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) को क्रॉस-पेश करने के लिए लक्षित एंटीजन डिलीवरी कुशलतापूर्वक टी प्रभावकार सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करती है और वैक्सीन डिजाइन में एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदर्शित करती है। एंटीजन को एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर्स जैसे डीईसी-205 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के माध्यम से डीसी को दिया जाता है जो तेज, प्रसंस्करण और MHC वर्ग I-और II-प्रस्तुति को प्रेरित करते हैं।
एक उपयुक्त एंटीबॉडी के लिए वांछित एंटीजन का कुशल और विश्वसनीय संाधीनता डीसी लक्ष्यीकरण में एक महत्वपूर्ण कदम है और अन्य कारकों के बीच एंटीजन के प्रारूप पर निर्भर करता है। एंटीबॉडी को शुद्ध करने के लिए पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन का रासायनिक संविलियन एक संभावित रणनीति है। अतीत में, हमने चूहों में अध्ययन को लक्षित करने वाले वीवो डीसी में मॉडल एंटीजन ओवलब्यूमिन (ओडब्ल्यूए) और एक डीईसी-205-विशिष्ट IgG2a एंटीबॉडी (αDEC-205) को सफलतापूर्वक क्रॉस-लिंकिंग की स्थापना की है। प्रोटोकॉल का पहला कदम एनएलडीसी (नॉन-लिम्फोइड डेंड्रिटिक कोशिकाओं) के सुपरनिटेंट से एंटीबॉडी का शुद्धिकरण है- 145 हाइब्रिडोमा एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी द्वारा। शुद्ध एंटीबॉडी को सल्फो-एसएमसीसी (सल्फोस्यूसिनिमिडिल 4-[एन-मालेमिडोमेथिल] साइक्लोहेक्सेन-1-कार्बोक्सिलेट) द्वारा रासायनिक संयुग्मण के लिए सक्रिय किया जाता है, जबकि उसी समय ओवीए प्रोटीन के सल्फ्रीडिल-समूह टीसीईपी-एचसीएल (ट्राइस (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड) के साथ इनक्यूबेशन के माध्यम से उजागर होते हैं। अतिरिक्त टीएमईपी-एचसीएल और सल्फो-एसएमसीसी को हटा दिया जाता है और एंटीजन को रातोंरात युग्मन के लिए सक्रिय एंटीबॉडी के साथ मिलाया जाता है। जिसके परिणामस्वरूप αDEC-205/OVA conjugate केंद्रित है और अनबाउंड OVA से मुक्त है । αDEC-205 के लिए OVA के सफल conjugation पश्चिमी दाग विश्लेषण और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा सत्यापित किया जाता है।
हमने सफलतापूर्वक उपयोग किया है, लिवर में साइटोटॉक्सिक टी सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए रासायनिक क्रॉसलिंक-αDEC-205/OVA का उपयोग किया है और डीईसी-205+ डीसी के वीवो लक्ष्यीकरण में निम्नलिखित ह्यूमरल और सेलुलर प्रतिरक्षा को प्रेरित करने में उनकी क्षमता के लिए विभिन्न एडजुवेंट्स की तुलना करने के लिए। इसके अलावा, इस तरह के रासायनिक युग्मित एंटीबॉडी/एंटीजन conjugates ट्यूमर एंटीजन के लिए वैक्सीन प्रतिक्रियाओं के कुशल प्रेरण के लिए मूल्यवान उपकरण प्रदान करते है और रोकथाम और ट्यूमर के विभिंन प्रकार की चिकित्सा के बारे में शास्त्रीय प्रतिरक्षण दृष्टिकोण से बेहतर साबित हो गया है ।
Introduction
डेंड्रिटिक कोशिकाएं (डीसी) प्रतिरक्षा प्रणाली के केंद्रीय खिलाड़ी हैं। वे एंटीजन-प्रस्तुति में विशिष्ट कोशिकाओं के एक विविध समूह हैं और उनका प्रमुख कार्य जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा को पाटना है1,2। महत्वपूर्ण बात यह है कि डीसी न केवल कुशल और विशिष्ट रोगजनक निर्देशित प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं बल्कि एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा1,3के कई पहलुओं में भी शामिल हैं।
मेजबान प्रतिरक्षा में उनकी विशेष भूमिका के कारण, डीसी टीकाकरण4के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में ध्यान में आया । एक दृष्टिकोण एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए वीवो में डीसी को एंटीजन को लक्षित करना है और पिछले वर्षों में, बड़ी संख्या में अध्ययन उपयुक्त रिसेप्टर्स को परिभाषित करने और रणनीतियों को लक्षित करने के लिए समर्पित किए गए हैं1,4। इसका एक उदाहरण सी-टाइप लेक्टिन रिसेप्टर डीईसी-205 है, जिसे एंडोसाइटोसिस को प्रेरित करने के लिए डीईसी-205-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा लक्षित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि उपयुक्त एडजुवेंट के साथ संयोजन में डीईसी-205 को लंबे समय तक रहने वाले और सुरक्षात्मक सीडी 4 + और सीडी 8+ टी कोशिकाओं के साथ-साथ एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को भी ट्यूमर एंटीजन3, 5, 6,7,8,9के खिलाफ कुशलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है।
ऐसे कई अध्ययन हैं जिनमें डीसी को लक्षित एंटीजन को मुक्त संयुक्त राष्ट्र-संयुग्मित एंटीजन3,5,10, 11,12से बेहतर होने का लक्ष्य दिया गया है । इससे संबंधित डीसी को एंटीजन का संजीदिय होना पड़ता है, जिसमें डीसी लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण में एक केंद्रीय कदम है। एंटीबॉडी या एंटीबॉडी टुकड़े के माध्यम से डीसी लक्ष्यीकरण के मामले में, एंटीजन या तो रासायनिक या आनुवंशिक रूप से जुड़ा हो सकता है और या तो रणनीति अपने स्वयं के (dis) लाभ प्रदान करता है1। एक तरफ, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एंटीबॉडी-एंटीजन निर्माण में एंटीजन खुराक पर नियंत्रण के साथ-साथ बहुत सारे1के बीच बेहतर तुलनीयता प्रदान करने वाला स्थान है। इसके साथ ही, रासायनिक संविलियन को कम तैयारी की आवश्यकता होती है और विशेष रूप से प्रयोगात्मक और पूर्व-नैदानिक मॉडलों में विभिन्न एंटीजन और/या टीकाकरण रणनीतियों का परीक्षण और तुलना करने का प्रयास करते समय अधिक लचीलापन प्रदान करता है ।
यहां, हम एक मॉडल प्रोटीन एंटीजन के रूप में अंडाकार (ओवीए) के कुशल और विश्वसनीय रासायनिक संयुग्मण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो चूहों में वीवो डीसी लक्ष्यीकरण में उपयुक्त है। सबसे पहले, αDEC-205 एनएलडीसी-145 हाइब्रिडोमा कोशिकाओं13से शुद्ध है। रासायनिक संयुग्मण के लिए, हेट्रोबिफंक्शनल क्रॉसलिंकर सल्फोसुक्यूनिमिडिल 4-[एन-मलीमिडोमेथिल] साइक्लोहेक्सेन-1-कार्बोक्सिलेट (सल्फो-एसएमसीसी), जिसमें एनएचएस (एन-हाइड्रोक्सीस्यूसिनिमाइड) एस्टर और मलीमाइड समूह शामिल हैं, का उपयोग किया जाता है, जिससे अमीन और सल्फीड्रिल-युक्त अणुओं के सहसंयोजक conjugation की अनुमति होती है । विशेष रूप से, एंटीबॉडी के प्राथमिक अमीन शुरू में सल्फो-एसएमसीसी और परिणामस्वरूप मलीमाइड-सक्रिय αDEC-205 के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, फिर टीएमईपी-एचसीएल (ट्राइस (2-कार्बोक्सीथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड) के माध्यम से कम सल्फ्लाइड्रिल युक्त ओवा प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करता है। अंतिम उत्पाद रासायनिक रूप से αDEC-205/OVA(चित्रा 1)है । रासायनिक संयुग्मण से परे, हमारा प्रोटोकॉल संयुग्म से अतिरिक्त ओवी को हटाने के साथ-साथ पश्चिमी दाग विश्लेषण और एक विशिष्ट एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख के माध्यम से सफल संयुग्मण के सत्यापन का वर्णन करता है। हमने अतीत में इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक नियोजित किया है ताकि ओडब्ल्यूए और अन्य प्रोटीन या इम्यूनोजेनिक पेप्टाइड्स को αDEC-205 तक रासायनिक रूप से संयोजित किया जा सके । हम विट्रो में सीडी 11सी+ कोशिकाओं के साथ – साथ वीवोमें सेलुलर और ह्यूमरल इम्युनिटी के कुशल प्रेरण के लिए कुशल बाध्यकारी प्रदर्शन करते हैं ।
निश्चित रूप से, इस विधि के लिए कमियां हैं जैसे कि बहुत-से-बहुत तुलनीयता और अंतिम संजूगेट के भीतर एंटीजन की सटीक डोजिंग में। फिर भी, रासायनिक संवजन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर निर्माणों की तुलना में एंटीबॉडी और प्रोटीन एंटीजन की पसंद में प्रयोगात्मक लचीलापन प्रदान करता है। इसलिए, हमारा मानना है कि यह दृष्टिकोण पूर्व-नैदानिक माउस मॉडल में डीसी लक्ष्यीकरण में उनकी दक्षता के लिए विभिन्न एंटीजन का मूल्यांकन करने में विशेष रूप से मूल्यवान है, महत्वपूर्ण रूप से विशिष्ट एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के संदर्भ में भी।
Protocol
Representative Results
Discussion
एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर-विशिष्ट एंटीबॉडी और प्रोटीन एंटीजन का रासायनिक संयुग्मण एक कुशल और महत्वपूर्ण बात यह है कि प्री-क्लीनिकल माउस मॉडल में वीवो डीसी लक्ष्यीकरण के लिए लचीला दृष्टिकोण भी प्रदा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए एस प्रीटिन का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को हेल्महोल्ट्ज एसोसिएशन ऑफ जर्मन रिसर्च सेंटर्स (एचजीएफ) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था जिसे हेल्महोल्ट्ज़ एलायंस ‘इम्यूनोथेरेपी ऑफ कैंसर’ (HCC_WP2b) के हिस्से के रूप में प्रदान किया गया था।
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines–hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans’ cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
