체외 및 비보에서 마우스 수지상 세포를 대상으로 하는 전체 길이 단백질을 가진 정제 된 DEC-205 지향 항체의 화학 적 융합
Summary
당사는 생체 내 수지상 세포 표적화를 위한 내분균 수용체 특이적 항체에 대한 모델 항원 배부안의 화학적 결합을 위한 프로토콜을 기술한다. 이 프로토콜은 항체의 정제, 항원의 화학적 융합, 공자의 정제 및 효율적인 유도의 검증을 포함한다.
Abstract
생체 내에서 수지상 세포(DC)를 교차 제시하는 표적 항원 전달은 T 이펙터 세포 반응을 효율적으로 유도하고 백신 설계에 있어 귀중한 접근법을 표시한다. 항원은 섭취량, 처리 및 MHC 급 I-및 II-프레젠테이션을 유도하는 DEC-205와 같은 내분비수용체에 특이적 항체를 통해 DC에 전달된다.
적합한 항체에 원하는 항원을 효율적이고 신뢰할 수 있는 유도는 DC 표적화에 중요한 단계이며 다른 요인들 사이에서는 항원의 형식에 달려 있다. 정제된 항체에 대한 전길이 단백질의 화학적 융합은 하나의 가능한 전략이다. 과거에는 마우스에서 생체내 DC 표적 연구를 위한 모델 항원 ovalbumin(OVA)과 DEC-205 특이적 IgG2a 항체(αDEC-205)의 교차 연결을 성공적으로 확립했습니다. 프로토콜의 첫 번째 단계는 NLDC(비 림프수성 수지상 세포)-145 hybridoma의 상퍼상에서 항체의 정제이다. 정제된 항체는 설포-SMCC(설포스쿠치니미딜 4-[N-maleimidomethyl] 사이클로헥산-1-카박스실레이트)에 의해 화학적 결합을 위해 활성화되는 동시에 OVA 단백질의 황피드릴-그룹은 TCEP-HCl(2-카로이)을 가진 배양을 통해 노출된다. 과잉 TCEP-HCl 및 설포-SMCC는 제거되고 항원들은 밤새 결합을 위한 활성 항체와 혼합된다. 생성된 αDEC-205/OVA 컨쥬게이트는 비바운드 OVA에서 농축되고 해방됩니다. ΑDEC-205에 대한 OVA의 성공적인 결합은 서양 블롯 분석 및 효소 연계 면역소벤트 분석(ELISA)에 의해 검증된다.
우리는 성공적으로 간에서 세포 독성 T 세포 반응을 유도하고 DEC-205+ DC의 생체 내 표적에 따라 유머 및 세포 면역을 유도에 자신의 잠재력에 대한 다른 보조제를 비교하기 위해 화학적으로 교차 αDEC-205 / OVA를 사용했다. 그 외에도, 이러한 화학적으로 결합된 항체/항원 접합체는 종양 항원에 대한 백신 반응의 효율적인 유도를 위한 귀중한 도구를 제공하며 다양한 유형의 종양의 예방 및 치료에 관한 고전적인 예방 접종 접근법보다 우수하다는 것이 입증되었습니다.
Introduction
수지상 세포 (DC)는 면역 계통의 중앙 선수입니다. 그(것)들은 항원 프리젠 테이션에 전문화된 세포의 다양한 단이고 그들의 주요 기능은 선천적이고 적응성 면역1,2를다리를 하는 것입니다. 중요한 것은, DC는 효율적이고 특정 병원체 지향 반응에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 항종양 면역1,3의많은 측면에 관여한다.
호스트 면역에서 그들의 독점적인 역할 때문에, DC는 백신접종4를위한 표적 세포로 집중하게 되었습니다. 한 가지 접근법은 항원 특이적 면역 반응을 유도하기 위해 생체 내에서 DC에 항원을 표적으로 하고 지난 몇 년 동안,많은 연구가 적합한 수용체를 정의하고 전략을1,4로지정하는 데 전념해 왔다. 한 가지 예는 C형 렉틴 수용체 DEC-205이며, 이는 내분비증을 유도하기 위해 DEC-205 특이적 항체에 의해 표적으로 할 수 있다. 중요한 것은, DEC-205 표적화는 적절한 보조제와 의 조합으로 수명이 다수 및 보호 CD4+ 및CD8+ T 세포뿐만 아니라 항체 반응뿐만 아니라, 종양 항원3,5,6,7,8,9에대해 효율적으로 유도하는 것으로 나타났다.
DC를 대상으로 한 공주항원을 보여주는 여러 연구가 있는데, 이는 공주항원3,5,10,11,12보다우수하다. 이를 통해 각 DC에 항원을 합산하여 DC 표적화 접근법의 중심 단계인 모이티를 표적으로 한다. 항체 또는 항체 단편을 통한 DC 표적화의 경우, 항원은 화학적으로 또는 유전적으로 연결될 수 있으며 어느 전략중 하나는 자체(dis)의 장점을제공한다. 한편, 유전자 조작된 항체-항원 구조에서는 로트1사이의 우수한 비교성을 제공하는 위치뿐만 아니라 항원 투여량에 대한 제어가 있다. 그러나 동시에 화학 적 융합은 더 적은 준비가 필요하며 특히 실험 및 전임상 모델에서 다른 항원 및 / 또는 예방 접종 전략을 테스트하고 비교하려고 할 때 더 많은 유연성을 제공합니다.
여기서, 우리는 OValbumin (OVA)의 효율적이고 신뢰할 수있는 화학 적 연상을 위한 프로토콜을 12-205 특이적 IgG2a 항체 (αDEC-205)로 단백질 항원으로 마우스에서 생체 내 DC 표적화에 적합한 프로토콜을 제시한다. 먼저, αDEC-205는 NLDC-145 혼종세포로부터 정제된다(13). 화학적 결합을 위해, 이트로비기능 크로스링커 설포시치니미딜 4-[N-maleimidomethyl] CYclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), NHS (N-하이드록시스쿠니미드) 에스테르와 말리미드 군을 포함하는, 유자 결합을 허용- 유체 결합- 유체 – 유체 – 분자의 결합을 허용. 구체적으로, 항체의 1차 아민은 처음에 황포-SMCC와 반응하고 그 결과 남성-염활성 αDEC-205는 TCEP-HCl(Tris(2-carboxyethyl) 인산염염을 통해 감소된 황피드릴 함유 OVA 단백질과 반응한다. 최종 제품은 화학적으로 cojujugated αDEC-205/OVA(그림 1). 화학 적 공짜 자체를 넘어, 우리의 프로토콜은 공자에서 과잉 OVA의 제거뿐만 아니라 서쪽 얼룩 분석 및 특정 효소 연결 면역 소르벤트 분석을 통해 성공적인 컨쥬게이션의 검증을 설명합니다. 우리는 성공적으로 αDEC-205에 OVA 및 그밖 단백질 또는 면역원성 펩티드를 화학적으로 컨쥬게이트하기 위하여 과거에 이 접근을 성공적으로 채택했습니다. 우리는 생체 내 의 CD11c+ 세포뿐만 아니라 생체 내세포 및 유머 면역의 효율적인 유도에 효율적인 결합을 입증한다.
확실히, 최종 컨쥬게이트 내에서 항원의 정확한 투약에 로트-투-로트 비교및 와 같은 이 방법에 대한 단점이 있다. 그럼에도 불구하고, 화학 적 융합은 유전자 조작 된 구조에 비해 항체 및 단백질 항원의 선택에 실험적 유연성을 제공합니다. 따라서, 우리는 이 접근법이 임상 전 마우스 모형에 있는 DC 표적화에 있는 그들의 효율성을 위해 다른 항원 평가에 특히 가치가 있다고 믿습니다, 또한 특정 항종양 면역 반응의 맥락에서.
Protocol
Representative Results
Discussion
내분세포증 수용체 특이적 항체 및 단백질 항원의 화학적 결합은 임상 전 마우스 모델에서 생체 내 DC 표적화에 대한 효율적이고 또한 유연한 접근법을 제공한다. 우리의 프로토콜을 통해 우리는 모델 항원 OVA를 DEC-205 특이적 IgG 항체로 성공적으로 결합하기 위한 효율적인 접근법을 제공합니다.
우리의 프로토콜에서 αDEC-205는 혼종 세포주에서 정제되고 과거에, 우리는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 전문 기술 지원을 위한 S. Prettin에게 감사드립니다. 이 작품은 헬름홀츠 얼라이언스의 일환으로 제공된 독일 연구 센터 (HGF)의 헬름홀츠 협회 (HGF)의 보조금에 의해 지원되었다 “암의 면역 요법”(HCC_WP2b).
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines–hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans’ cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
