Coniugazione chimica di un anticorpo purificato dec-205 diretto con proteina a lunghezza intera per il targeting di cellule dendritiche di topo in vitro e in vivo
Summary
Descriviamo un protocollo per la coniugazione chimica dell’antigene modello ovalbumina ad un anticorpo specifico del recettore dell’endocitosi per il targeting delle cellule dendritiche in vivo. Il protocollo comprende la purificazione dell’anticorpo, la coniugazione chimica dell’antigene, nonché la purificazione del coniugato e la verifica di una coniugazione efficiente.
Abstract
La somministrazione mirata di antigene a cellule dendritiche a presentazione incrociata (DC) in vivo induce in modo efficiente le risposte delle cellule effettrici T e mostra un approccio prezioso nella progettazione del vaccino. L’antigene viene consegnato a DC tramite anticorpi specifici per i recettori dell’endocitosi come DEC-205 che inducono l’assorbimento, l’elaborazione e la presentazione di MHC di classe I e II.
La coniugazione efficiente e affidabile dell’antigene desiderato con un anticorpo adatto è un passo critico nel targeting DC e tra gli altri fattori dipende dal formato dell’antigene. La coniugazione chimica di proteine a lunghezza intera in anticorpi purificati è una possibile strategia. In passato, abbiamo stabilito con successo il cross-linking dell’antigene modello ovalbumina (OVA) e di un anticorpo IgG2a specifico dec-205 (αDEC-205) per studi di targeting DC in vivo nei topi. Il primo passo del protocollo è la purificazione dell’anticorpo dal surnatante dell’ibridoma DENDRITICO NLDC (cellule dendritiche non linfoidi)-145 mediante cromatografia di affinità. L’anticorpo purificato viene attivato per la coniugazione chimica dal sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) mentre allo stesso tempo i gruppi sulfidrilici della proteina OAV sono esposti attraverso l’incubazione con TCEP-HCl (tris (2-carbossietil) fosfina cloridrato). L’eccesso di TCEP-HCl e sulfo-SMCC viene rimosso e l’antigene viene miscelato con l’anticorpo attivato per l’accoppiamento notturno. Il coniugato αDEC-205/OVA risultante viene concentrato e liberato da OAV non legati. Il successo della coniugazione dell’OAV in αDEC-205 è verificato mediante l’analisi western blot e il saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA).
Abbiamo utilizzato con successo αDEC-205/OVA reticolato chimicamente per indurre risposte citotossiche delle cellule T nel fegato e per confrontare diversi adiuvanti per il loro potenziale nell’indurre l’immunità umorale e cellulare a seguito del targeting in vivo di DEC-205+ DC. Oltre a ciò, tali coniugati anticorpo/antigene accoppiati chimicamente offrono strumenti preziosi per l’induzione efficiente delle risposte vaccinali agli antigeni tumorali e hanno dimostrato di essere superiori agli approcci di immunizzazione classici per quanto riguarda la prevenzione e la terapia di vari tipi di tumori.
Introduction
Le cellule dendritiche (DC) sono attori centrali del sistema immunitario. Sono un gruppo eterogeneo di cellule specializzate nella presentazione dell’antigene e la loro funzione principale è quella di colmare l’immunità innata e adattativa1,2. È importante sottolineare che i DC non solo svolgono un ruolo importante in risposte efficienti e specifiche dirette ai patogeni, ma sono anche coinvolti in molti aspetti dell’immunità antitumorale1,3.
A causa del loro ruolo esclusivo nell’immunità dell’ospite, dc è venuto a fuoco come cellule bersaglio per la vaccinazione4. Un approccio è quello di indirizzare gli antigeni a DC in vivo per indurre risposte immunitarie antigene-specifiche e negli ultimi anni, un gran numero di studi sono stati dedicati alla definizione di recettori adatti e strategie di targeting1,4. Un esempio è il recettore della lectina di tipo C DEC-205, che può essere preso di mira da anticorpi specifici DEC-205 per indurre l’endocitosi. È importante sottolineare che il targeting DEC-205 in combinazione con adiuvanti adatti ha dimostrato di indurre in modo efficiente cellule T CD4+ e CD8+ di lunga durata e protettive, nonché risposte anticorpali, anche contro gli antigeni tumorali3,5,6,7,8,9.
Ci sono un certo numero di studi che dimostrano che gli antigeni coniugati mirati alla DC sono superiori all’antigene libero non coniugato3,5,10,11,12. Ciò rende la coniugazione dell’antigene alla rispettiva porzione di targeting DC un passo centrale negli approcci di targeting DC. Nel caso del targeting DC tramite anticorpi o frammenti di anticorpi, gli antigeni possono essere collegati chimicamente o geneticamente e entrambe le strategie forniscono i propri (dis)vantaggi1. Da un lato, nei costrutti anticorpo-antigene geneticamente modificati esiste un controllo sulla dose di antigene e sulla posizione che fornisce una comparabilità superiore tra i lotti1. Allo stesso tempo, tuttavia, la coniugazione chimica richiede meno preparazione e fornisce maggiore flessibilità soprattutto quando si tenta di testare e confrontare diversi antigeni e / o strategie di vaccinazione in modelli sperimentali e pre-clinici.
Qui, presentiamo un protocollo per la coniugazione chimica efficiente e affidabile dell’ovalbumina (OVA) come antigene proteico modello a un anticorpo IgG2a specifico dec-205 (αDEC-205) adatto per il targeting DC in vivo nei topi. Innanzitutto, αDEC-205 viene purificato dalle cellule di ibridoma NLDC-14513. Per la coniugazione chimica, viene utilizzato il reticolante eterobifunzionale sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), che contiene estere NHS (N-idrossisuccinimide) e gruppi maleimmidi, consentendo la coniugazione covalente di molecole contenenti ammine e sulfidril. In particolare, le ammine primarie dell’anticorpo reagiscono inizialmente con sulfo-SMCC e il risultante αDEC-205 attivato dalla maleimmide reagisce quindi con la proteina OAV contenente sulfidrile ridotta attraverso TCEP-HCl (Tris(2-carbossietil) fosfina cloridrato). Il prodotto finale è αDEC-205/OVA coniugato chimicamente (Figura 1). Oltre alla coniugazione chimica stessa, il nostro protocollo descrive la rimozione dell’OVA in eccesso dal coniugato e la verifica del successo della coniugazione attraverso l’analisi western blot e uno specifico test immunoassorbente enzimatico. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio in passato per coniugare chimicamente l’OVA e altre proteine o peptidi immunogenici ad αDEC-205. Dimostriamo un legame efficiente alle cellule CD11c+ in vitro e l’induzione efficiente dell’immunità cellulare e umorale in vivo.
Certamente, ci sono degli svantaggi in questo metodo, come nella comparabilità da lotto a lotto e nel dosaggio esatto dell’antigene all’interno del coniugato finale. Tuttavia, la coniugazione chimica fornisce flessibilità sperimentale nella scelta dell’anticorpo e dell’antigene proteico rispetto ai costrutti geneticamente modificati. Pertanto, riteniamo che questo approccio sia particolarmente prezioso nella valutazione di diversi antigeni per la loro efficienza nel targeting DC in modelli murini pre-clinici, soprattutto anche nel contesto di specifiche risposte immunitarie antitumorali.
Protocol
Representative Results
Discussion
La coniugazione chimica di un anticorpo specifico del recettore dell’endocitosi e di un antigene proteico fornisce un approccio efficiente e, soprattutto, anche flessibile per il targeting DC in vivo in modelli murini pre-clinici. Con il nostro protocollo forniamo un approccio efficiente per la coniugazione di successo dell’antigene modello OAV a un anticorpo IgG specifico dec-205.
Nel nostro protocollo, αDEC-205 viene purificato da una linea cellulare di ibridoma e in passato abbiam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano S. Prettin per l’assistenza tecnica esperta. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell’Associazione Helmholtz dei centri di ricerca tedeschi (HGF) che è stata fornita come parte dell’Alleanza Helmholtz “Immunoterapia dei tumori” (HCC_WP2b).
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
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